多克隆抗體的制備

1、實驗一 多克隆抗體制備,微生物與免疫教研室周芳美,一、實驗?zāi)康?掌握多抗制備的原理和過程熟悉常用的佐劑掌握福氏完全佐劑的作用機理和制備方法掌握研磨法和注射器法制備免疫乳劑，掌握制備成功的判別標(biāo)準(zhǔn)掌握動物的免疫方法,二、實驗原理,抗體：介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細胞接受抗原激活后增殖分化為漿細胞所合成分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體：抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決

2、定簇激活具有相應(yīng)抗原受體的B細胞產(chǎn)生的針對這一抗原決定簇的抗體，稱為···,天然抗原分子中常含有多種不同抗原特異性的抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活，產(chǎn)生的抗體中含有針對多種不同抗原表位的免疫球蛋白，稱為多克隆抗體。,多克隆抗體,多克隆抗體制備的意義,免疫血清：將抗原注入機體所產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，含有這種特異性抗體的血清。免疫血清作用：對傳染病的診斷、

3、預(yù)防和治療有重要意義，而且對器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。,多克隆抗體優(yōu)缺點： 優(yōu)點 ：作用全面，具有中和抗原，免疫調(diào)理，介導(dǎo)補體介導(dǎo)的細胞毒作用，ADCC等作用，來源廣泛，制備容易。 缺點：特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而應(yīng)用受限。,三、實驗試劑與材料,動物：健康家兔抗原：生化大實驗中制備的LDL佐劑：弗氏佐劑注射器、研缽 等,動物的選擇,動物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)如要獲

4、得大劑量的抗體，則采用大動物；如要獲得直接標(biāo)記診斷用的抗體，則直接采用本動物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動物制備抗體,動物的選擇,如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，免疫時應(yīng)同時選用數(shù)只動物進行免疫一般實驗室采用的抗體，多用兔子和羊；,抗原,就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等.根據(jù)物理性狀可分為顆粒型抗原和可溶性抗原。

5、就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原,不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種免疫原性的強弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團、立體結(jié)構(gòu)、物理形狀和彌散速度等本次實驗采用抗原是生科大實驗制備的LDL（至少有2mg，如量不夠則用牛血清白蛋白），用生理鹽水溶解。,抗原劑量的選擇,抗原的免疫劑量依照給予抗原的種類，免疫次數(shù)，注射途徑，以及受體動物的種類，免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。劑

6、量過低，不能形成足夠強的免疫刺激劑量過高，有可能造成耐受在一定范圍內(nèi)，抗體效價隨注射抗原的劑量而增高。,抗原劑量的選擇,小鼠首次抗原劑量為：50-400μg/次大鼠為100-1000μg/次兔子為200-1000μg/次加強免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5,佐劑,概念：預(yù)先與抗原同時注入體內(nèi)，可增強機體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的非特異性免疫增強性物質(zhì)。種類：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分

7、枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。目前應(yīng)用最多的是弗氏佐劑。,佐劑,佐劑的條件作為一種良好的佐劑，必須具備下列條件： （1）增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性； （2）佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，減低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體； （3）佐劑可以直接或間接激活免疫活性細胞

8、并使之增生，從而增強了體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫功能； （4）良好的佐劑應(yīng)具有無毒性或副作用低的特點。,佐劑,主要作用機制：①改變抗原物理性狀，延緩抗原的降解和排除，延長抗原在體內(nèi)滯留的時間②刺激單核-巨噬細胞系統(tǒng)，增強其對抗原的處理和提呈能力③刺激淋巴細胞的增殖分化，從而增強和擴大免疫應(yīng)答的能力,佐劑,主要用途：①增強特異性免疫應(yīng)答，用于預(yù)防接種及制備動物免疫血清②作為非特異性免疫增強劑，用于抗腫瘤與抗感染的輔助治

9、療,弗氏佐劑,動物實驗中最常用的佐劑：①弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant IFA) 羊毛脂 1 份 +石蠟油 5 份，混合，高壓滅菌后保存。用時加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進行乳化處理。 ②弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA) 弗氏不完全佐劑 10ml +卡介苗 10mg～200mg 卡介苗可1

10、00℃10min滅活處理。,四、步驟和方法,顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）1、傷害桿菌O抗原的制備：,,接種,37℃ 18-24h,洗下菌苔（用NS）,,100℃ 1h,過濾,,4000r/min,20min,得到原液,,稀釋,109/ml應(yīng)用液,顆粒性抗原多克隆抗體的制備——傷害桿菌O抗血清的制備（介紹）,2、免疫方法： 選擇體重2-3kg的健康家兔，將已經(jīng)稀釋好的抗原按下列劑量及程序做皮內(nèi)注

11、射。第一天注射1ml，第8天注射1ml，第15天注射2ml，末次注射后7天頸動脈放血，測效價。,可溶性抗原多克隆抗體的制備,第一次免疫（基礎(chǔ)免疫）,第一次加強免疫,第二次加強免疫,效價測定,2-4周,2-3周,,,,7天,第一次免疫（基礎(chǔ)免疫）,免疫乳劑的制備①研磨法: 取1.2ml佐劑加入到無菌的研缽中，緩慢加入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴研磨至小滴消失，邊加邊往同一個方向研磨，抗原全部加入后繼續(xù)研磨至乳白色

12、粘稠的油包水乳劑。,①研磨法,本法適于制備大量的佐劑抗原，缺點是研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大。注意事項：⑴每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失，滴加速度要慢⑵邊加邊往同一方向研磨，否則不易制成乳白色粘稠的油包水乳劑，免疫效果就差。,免疫乳劑的制備,②注射器法： 取1.2ml佐劑+1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，用兩個注射器用皮管對接，使佐劑和抗原往返推拉，直至乳化完全。 適用于制備少量的抗原乳劑。本法優(yōu)點是容易做到無

13、菌操作，抗原損失少。,免疫乳劑制備成功的判別標(biāo)準(zhǔn),油包水狀態(tài) 鑒定方法是將乳化劑滴入4℃左右冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。,免疫,將制成的乳劑吸入注射器，在兔子背部及頸部皮下注射8-10點，每點約0.2ml每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多點注射加強免疫,每點0.2ml,共加強2次。第二次加強免疫開始,在免疫后第7天用免疫雙擴散法檢查抗體效價。,思考題,佐劑的

14、種類有哪些？佐劑的作用原理是什么？有何用途弗氏佐劑中弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑有何區(qū)別？抗原的免疫原性與哪些因素有關(guān)？,第一次加強免疫,實驗?zāi)康?1.掌握多克隆抗體的應(yīng)答特點 2.理解加強免疫的作用和必要性 3.加強動物技能,實驗原理,體液免疫的一般規(guī)律 在抗原誘導(dǎo)下，漿細胞產(chǎn)生的抗體經(jīng)淋巴液和血液流向全身，血液中抗體的濃度隨應(yīng)答時間的持續(xù)而增高。在初次接受抗原刺激中，機體發(fā)生初次應(yīng)答，再次接受相同抗原刺激，機體產(chǎn)

15、生二次應(yīng)答或稱回憶應(yīng)答。,初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的特點和比較,加強免疫的作用和必要性,再次應(yīng)答，增加抗體量增強抗體的親和力,材料和試劑,試劑：LDL抗原溶液，佐劑材料：注射器，研缽，消毒棉球,實驗步驟,免疫乳劑的制備（注射器法和研缽法任選） 取抗原溶液（基礎(chǔ)免疫的2/5）+弗氏不完全佐劑制備成油包水狀態(tài).免疫 將制成的乳劑吸入注射器，在兔子背部及頸部皮下注射，每點約0.2ml.,第二次加強免疫,實驗原理及方法同第一次加強