糖尿病的分子機制

1、,糖尿病的分子機制,11級病理班,2,,唐同學(xué)，男，15歲。三個月前受涼感冒，之后常感覺口渴、總想喝水、感覺沒有力氣，體重減輕5斤。診斷：1型糖尿病，糖尿病酮癥酸中毒。,1型糖尿病,IDDM是人類一種內(nèi)分泌疾病，多數(shù)情況下是由自身免疫系統(tǒng)損傷了胰島β細胞所致的當(dāng)胰腺中超過了90％的β細胞受損時出現(xiàn)臨床表現(xiàn)（空腹高血糖，糖尿及酮癥酸中毒）,,1型糖尿病的分類,免疫介導(dǎo)糖尿病（1A） 特發(fā)性糖尿

2、病(1B),1A研究中使用的動物模型,NOD小鼠（非肥胖糖尿病小鼠） BB大鼠（Biobreading大鼠）,證實了T細胞是β細胞破壞的啟動者和最終效應(yīng)者,NOD小鼠,NOD小鼠的MHC中缺乏Ⅱ類E（與HLA-DR同源）,1A發(fā)病與HLA復(fù)合物上DQ-A和DQ-B有關(guān),自身抗原到底是胰島素還是谷氨酸脫羧酶（GAD）?,自身免疫的胰腺炎,,白細胞:胰島外周積累除了ER-MP25+

3、還有MOMA-1+巨噬細胞:BM8+巨噬細胞T淋巴細胞:CD4+>CD8+B淋巴細胞:對T淋巴細胞有輔助作用（APC）,,,直接和間接,B淋巴細胞的輔助作用,,NOD/Jsd小鼠,NOD/Lt小鼠,實驗,,發(fā)病雌性NOD小鼠,,CD4+和CD25+的T細胞增多,未發(fā)病雌性NOD小鼠,,CD4+和CD25+的T細胞未增多,通過RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)病的NOD小鼠的CD4+T細胞更偏向于分泌輔助細胞TH1的致炎淋巴因子，其中

4、尤其是INF-γ。,自身免疫的胰腺炎,,還有研究表明當(dāng)T細胞誘導(dǎo)發(fā)育為TH2時不會者產(chǎn)生1A,IL-12和IL-18是T淋巴細胞向TH1分化的相關(guān)細胞因子,NOD/Born（環(huán)磷酰胺加速糖尿病發(fā)病的NOD小鼠）,LADA和1B,,LADA（成人隱匿性免疫糖尿?。?1B,β細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),,死亡受體介導(dǎo)的信號途徑,線粒體途徑,顆粒酶B途徑,死亡受體介導(dǎo)的信號途徑,,IFN-γ,B細胞,Fas,DISC,Fas受體多聚化,誘導(dǎo),表達

5、,,募集,Caspase8/10,DD,FADD,使Caspase8水解活化激活效應(yīng)Caspase3,6,7,線粒體途徑,,激活效應(yīng)Caspase-3，6，7,,顆粒酶B途徑,,顆粒酶B存在于CTL細胞和NK細胞中,T細胞活化之后會釋放顆粒酶和穿孔素,激活Caspase3，7，8，10,Caspase（半胱天冬蛋白酶）,,通過剪切核內(nèi)底物（核纖層蛋白，細胞骨架蛋白等）使細胞凋亡,II型糖尿病患者不需要依靠胰島素，可以使用口服降糖藥

6、物來控制血糖，又稱非胰島素依賴糖尿病。所謂的"2型糖尿病"，是各種致病因素的作用下，經(jīng)過漫長的病理過程而形成的。由于致病因子的存在，正常的血液結(jié)構(gòu)平衡被破壞，血中胰島素效力相對減弱，經(jīng)過體內(nèi)反饋系統(tǒng)的啟動，首先累及胰島，使之長期超負荷工作失去代償能力。再繼續(xù)下去，就像強迫一個帶病的人干活一樣，最終累死。,2型糖尿病,2型的發(fā)病機制,,,胰島素抵抗的機制,胰島β細胞凋亡的機制,胰島素的信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,胰島素受體(INS

7、R)胰島素受體是一個四聚體，由兩個α亞基和兩個β亞基通過二硫鍵連接。兩個α亞基位于細胞質(zhì)膜的外側(cè)，其上有胰島素的結(jié)合位點；兩個β亞基是跨膜蛋白，起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。無胰島素結(jié)合時，受體的酪氨酸蛋白激酶沒有活性。當(dāng)胰島素與受體的α亞基結(jié)合并改變了β亞基的構(gòu)型后，酪氨酸蛋白激酶才被激活，激活后可催化兩個反應(yīng)∶①使四聚體復(fù)合物中β亞基特異位點的酪氨酸殘基磷酸化,這種過程稱為自我磷酸化②將胰島素受體底物(IRS)上具有重要作用的十幾個酪氨酸

8、殘基磷酸化，磷酸化的IRS能夠結(jié)合并激活下游效應(yīng)物。,什么是胰島素抵抗,IR是指機體在一定量的胰島素水平作用下,葡萄糖攝取和處理能力降低,肌細胞和脂肪細胞不能利用糖,以及肝細胞不能有效抑制糖原分解和糖異生,而向血中釋放過多葡萄糖,致使血糖濃度增高。,(1)從胰島素基因水平,1.1胰島素分子上的某一個氨基酸被代替，而此氨基酸對胰島素的生物活性起關(guān)鍵性作用,1.2胰島素原轉(zhuǎn)換為胰島素的過程中，正常的咸基殘端被裂開。,B52突變（苯丙氨酸

9、 亮氨酸） INS一級結(jié)構(gòu)改變----受體結(jié)合障礙。,65位（精氨酸 非咸性氨基酸） 蛋白酶識別點消失 INS加工障礙胰島素原在C肽和B鏈之間斷裂 妨礙受體識別,,,,,,,（2）從胰島素受體水平,編碼受體的基因改變,胰島素受體基因突變導(dǎo)致正常受體數(shù)量減少：受體降解加速：受體酪氨酸酶活性降低：受體再利用障礙：受體與胰島素的親和力下降從而導(dǎo)致胰島素抵抗，此時胰島素β細胞代償

10、性分泌大量胰島素，形成高胰島素血癥，持續(xù)高胰島素血癥進一步降低胰島素的生物效應(yīng)，由此惡性循環(huán)。,（3）從胞內(nèi)水平,胰島素受體底物IRS,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K),葡萄糖激酶,糖原合成酶,胰島素受體底物IRS,基因突變 編碼胰島素受體IRS的基因發(fā)生突變導(dǎo)致正常irs減少引起IR,其他因素導(dǎo)致異常 腫瘤壞死因子(TNF)α和代謝物(多為FFA、葡萄糖)均可促使IRS的絲氨酸磷酸化而抑制酪氨酸磷酸化和胰島素

11、信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而導(dǎo)致IR;長期高血糖促使蛋白激酶C活化,催化胰島素受體底物絲氨酸磷酸化,抑制PI-3K活性,導(dǎo)致IR,IKK-β的活化進而催化胰島素受體底物 (IRS)特定部位的Ser/Thr殘基磷酸化，抑制信號分子的Tyr殘基磷酸化,導(dǎo)致IR。,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K),游離脂肪酸(FFA)釋放增多，血清FFA的升高可引起骨骼肌、肝臟的PI-3K活性降低，胰島素的信號傳導(dǎo)通路中斷，

12、 致使葡萄糖無法進入細胞內(nèi)參與代謝，引起IR。,葡萄糖激酶,在起病早期或伴明顯家族史的常見型2型糖尿病中見到GCK內(nèi)含子1b變異。導(dǎo)致該酶的結(jié)構(gòu)改變從而無法將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖。,糖原合成酶,在周圍組織對葡萄糖的非氧化攝取、合成糖原的過程中，糖原合成酶（GSY）基因產(chǎn)物起到重要作用。這一過程的受阻可引起周圍組織對胰島素的抵抗IR，,在2型糖尿病患者GSY基因中發(fā)現(xiàn)了雙核苷酸復(fù)序列多態(tài)性（TG）。它位于19號染色體載脂蛋白C-2

13、及富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白基因之間，擁有10個等位基因，雜合度0.82，在2型糖尿病發(fā)病及胰島素抵抗中的作用機制尚待進一步研究。,胰島β細胞凋亡,炎癥應(yīng)激氧化應(yīng)激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激糖毒性作用脂毒性作用,炎癥應(yīng)激,高糖可誘導(dǎo)胰島細胞IL-1β合成和分泌，促進Fas觸發(fā)的β細胞凋亡。在2型糖尿病患者中浸潤于胰島的巨噬細胞也可產(chǎn)生IL-1β[35] 。,氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用

14、失衡，傾向于氧化，導(dǎo) 致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增 加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。 高血糖的致病作用在很大程度上是通過活性氧簇 （ROS）、活性氮（RNS）生成和繼發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的。ROS、RNS除直接氧化損害 DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、大分子物質(zhì)外，還間接通過核因子κB（NF-κB）、p38絲裂原活化蛋白激酶、NH3末端Jun激酗應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK／SAPK）、己糖胺等細胞應(yīng)激敏感途徑損害組織。,在2型糖尿病患

15、者中，高血糖活化這些通路，但由于胰島β細胞的超氧物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶表達量低，進而抗氧化能力低，因此β細胞特別易受到氧化應(yīng)激的損害。,在2型糖尿病患者β細胞處于自由基的慢性增加和細胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)能力降低的環(huán)境，引起β 細胞凋亡。,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,各種原因?qū)е碌奈凑郫B蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 腔內(nèi)的積聚，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在胰島素抵抗和2型糖尿病時，由于胰島素原的合成增加，當(dāng)超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負荷，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，

16、其中由蛋白質(zhì)堆積所引起的一系列后續(xù)反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。未折疊蛋白反應(yīng)首先表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成暫停，隨著應(yīng)激反應(yīng)蛋白基因表達，可進一步改善細胞生理狀態(tài)。但當(dāng)應(yīng)激原強度超過細胞自身處理能力時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也會誘導(dǎo)特有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)性細胞凋亡通路，誘導(dǎo)β細胞凋亡。,糖毒性作用,長期高血糖可能影響參與凋亡的基因表達，通過改變Bcl蛋白家族之間的平衡來調(diào)節(jié)β細胞凋亡水平。Federici等發(fā)現(xiàn)在高

17、葡萄糖（16.7mmol/L） 條件下，高血糖能夠持續(xù)增加促凋亡基因Bad、Bid、Bik的表達，減少Bcl-xl抗凋亡基因的表達，而對Bcl-2抗凋亡基因的表達沒有影響。高血糖打破了促凋亡和抗凋亡之間的平衡，并向著凋亡的方向發(fā)展，促進胰島細胞凋亡。,脂毒性作用,FFA可通過增加合成鞘髓磷脂醇產(chǎn)物一?；拾贝迹ㄒ粋€細胞凋亡信息分子）導(dǎo)致β細胞凋亡，?；拾贝伎缮险{(diào)NF-κB的表達，而后者又可上調(diào)NO合酶的表達，使NO產(chǎn)生增加；FFA可以

18、通過一氧化氮獨立機制的影響使正常的胰島β細胞凋亡。,實驗設(shè)計,,尋找新的致病基因,一·實驗?zāi)康?進一步尋找新的目的基因,二·實驗原理 有方向：根據(jù)已有的方向進一步深入 無方向：用基因芯片的方法高通量篩選 科研的基本方法 伽利略：問題 提出猜想 設(shè)計實驗方案

19、 修正假說 結(jié)果對比 實驗驗證,,,,,,,（一）立題,提出問題：該往哪個方向研究？ 是圍繞胰腺展開 直面疾病

20、 還是舍而取其次轉(zhuǎn)攻其他相關(guān)的器官？文獻查詢：胰腺 腎臟 原則：實用性：有一定的臨床研究價值可行性：在實驗中不超過現(xiàn)有的實驗條件科學(xué)性：盡量根據(jù)已有的一些研究成果縮小一下目標范圍先進性：采用交心的前沿的技術(shù)和方法，以較先進的理論 作為研究的指導(dǎo),三 實驗設(shè)計,根據(jù)一中篩選的可疑基因， 通過查詢相關(guān)文獻進一步去除已知

21、的基因 篩選出新的可疑基因 再按可疑度的高低逐個依次研究 于是問題到這一步轉(zhuǎn)化成了：如何確定找到一個可疑的基因是否為致病基因,,,1·比較該基因在不同物種之間的分布,原因：人和實驗動物（如老鼠）畢竟是不同的， 有些基因?qū)嶒瀯游镉卸藳]有， 因此對人類而言也沒有進一步的臨床意義,,,,,人類有,Y,不

22、同親緣性動物對比,,換下一個,關(guān)于如何符合：,可以分不同的層次展開1·細胞水平：對人類某些組織細胞進行離體培養(yǎng)， 對某些基因進行操作（如基因的敲除、沉默、低表達、過表達） 觀察其對細胞的影響2·個體水平：小鼠 猴子 猩猩,,,驗證思路,不變

23、變,1· 基因 疾病,例：體外高糖培養(yǎng)小鼠腎小球足細胞 檢測NICDI表達與腎小球足細胞凋亡關(guān)系，并了解信號通路是否介導(dǎo)高糖對NOTCH通路的激活,2· 疾病 基因,，,,,思路：（1）先做基因改變，再致病 （2）先致病，再做基因改變,實例：,1.材料：2.細胞培養(yǎng)： 5% CO2 33攝氏度3.細胞分組4.western blotti