椪柑體細胞胚胎發(fā)生機理的初步研究.pdf

1、體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)在植物快繁、種質(zhì)資源保存、遺傳轉(zhuǎn)化、基因工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。已有研究表明，體細胞胚胎發(fā)生與氧化脅迫、DNA甲基化狀態(tài)等有密切關(guān)系。迄今，椪柑體細胞胚胎發(fā)生的生理與分子機理尚不清楚?；诖?，本論文以椪柑胚性愈傷組織為起始材料進行體細胞胚的誘導(dǎo)，分析該過程中其可溶性蛋白含量、三種抗氧化酶活力和活性氧水平的動態(tài)變化，以期了解抗氧化系統(tǒng)在體細胞胚胎發(fā)生中的作用;利用已公布的甜橙基因組數(shù)據(jù)，鑒定NADPH氧化

2、酶基因家族成員，分析它們在椪柑體細胞胚誘導(dǎo)過程中的表達情況，以期篩選出與體細胞胚胎發(fā)生的特異NADPH氧化酶基因;采用MSAP技術(shù)分析椪柑體細胞胚誘導(dǎo)過程中DNA甲基化水平和模式變化，以期初步揭示其表觀變化規(guī)律。主要研究結(jié)果如下:
　　1.選取椪柑體細胞胚誘導(dǎo)過程中四個階段的培養(yǎng)物:即剛接種的胚性愈傷組織(EI0)，轉(zhuǎn)成黃色的胚性愈傷組織(EI1)，肉眼可見的胚狀體(EI2)和出現(xiàn)50％以上的胚狀體(EI3)，進行可溶性蛋白含量、

3、H2O2水平及抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活力的測定。結(jié)果表明:可溶性蛋白含量先下降后逐漸升高;過氧化氫含量先逐漸上升后下降;從EI0到EI2過程三種酶活力都表現(xiàn)出先升高后下降的變化規(guī)律，但在EI2到EI3過程，POD、CAT活力下降，SOD活力則升高。
　　2.采用生物信息學(xué)方法在柑橘基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出13個柑橘NADPH氧化酶基因，并分析這些基因在椪柑體細胞胚誘導(dǎo)過程中的表達情況。結(jié)果表明，四個階段共檢測到8個基因（C

4、sRboh1、CsRboh2、CsRboh5、CsRboh6、CsRboh7、CsRboh10、CsRboh11和CsRboh12）的表達，且變化趨勢有明顯差異;未檢出表達的基因是CsRboh3、CsRboh4、CsRboh8、CsRboh9和CsRboh11。其中CsRboh7基因在EI2和EI3表達。
　　3.采用MSAP技術(shù)研究椪柑體細胞胚誘導(dǎo)過程中DNA甲基化水平和模式的變化。結(jié)果表明，椪柑體細胞胚發(fā)生過程中DNA甲基化整