豬傳染性胃腸炎病毒S與M基因的核酸疫苗載體構(gòu)建的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種世界性的高度接觸性腸道傳染病，尤其對(duì)感染后的新生仔豬死亡率高達(dá)100％，由于當(dāng)前沒(méi)有有效的治療途徑，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此尋找合適的治療方案成為至關(guān)重要的事情。本實(shí)驗(yàn)的理論依據(jù)：豬傳染性胃腸炎病毒S糖蛋白基因的全序列表達(dá)產(chǎn)物與只有抗原位點(diǎn)序列表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有明顯的差異，而且經(jīng)過(guò)剪切后含有抗原位點(diǎn)的S基因操作性更強(qiáng)，更有利于基因的重組；M膜蛋白的羧基端是病毒的免疫顯性區(qū)，針對(duì)此

2、區(qū)域的抗體可以中和TGEV。因此，我們以M基因和只含有主要抗原位點(diǎn)的S基因cDNA為表達(dá)序列，以牛β酪蛋白啟動(dòng)子的5'端和3'端調(diào)控序列作為指導(dǎo)構(gòu)件，采用不同的載體優(yōu)化方法，構(gòu)建豬傳染性胃腸炎病毒DNA疫苗表達(dá)載體。相關(guān)研究如下： 1.利用定向克隆的方法，將M膜蛋白基因表達(dá)序列克隆到初級(jí)乳腺表達(dá)載體pBCC上，然后定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，最終構(gòu)建了M膜蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pEBM。載體含有抗性基因和綠色熒光蛋

3、白(EGFP)報(bào)告基因，并報(bào)告基因和目的基因表達(dá)為非融合型表達(dá)。 2.利用雙酶切定向克隆的方法，成功的將豬傳染性胃腸炎病毒M基因與S基因有效融合在一起。并且保證讀碼框正確無(wú)誤，沒(méi)有發(fā)生影響表達(dá)的突變，將融合蛋白基因表達(dá)序列克隆到改造好的初級(jí)乳腺表達(dá)載體pBCP上，然后定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，從而構(gòu)建了M與S融合基因乳腺特異性表達(dá)載體pEBSMl。 3.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，