水產(chǎn)有益微生物的分離篩選及其調(diào)控養(yǎng)殖水環(huán)境的功能研究.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，池塘生態(tài)環(huán)境受到不同程度的破壞，C、N、P元素的污染加劇，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展影響巨大，養(yǎng)殖水環(huán)境亟待修復(fù)。本文主要從市售益生菌產(chǎn)品和養(yǎng)殖池塘底泥中分離得到大量有益微生物，對(duì)其水環(huán)境調(diào)控功能進(jìn)行分析和研究，并對(duì)功能菌種進(jìn)行篩選。研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　（1）有益微生物的獲得。底泥中微生物的分離及篩選：9份底泥樣品分別經(jīng)不同的液體培養(yǎng)基馴化、富集和固體平板的分離、純化，得到具有異養(yǎng)硝化、反硝化、亞硝酸

2、鹽降解、兼性脫氮和解磷功能的菌種各27株，共135株。通過(guò)測(cè)定功能菌種的氨氮、亞硝酸氮降解率和可溶性磷增加率，篩選出6株異養(yǎng)硝化菌（YY9-2等）、9株反硝化菌（FX5-1等）、7株亞硝酸鹽降解菌（YX8-2等）、6株兼性脫氮菌（TN1-3等）和7株解磷菌（P2-1等），共28株優(yōu)勢(shì)脫氮菌和7株解磷菌。益生菌產(chǎn)品中微生物的分離：通過(guò)稀釋涂布平板法和平板劃線法從市售益生菌產(chǎn)品中分離、純化得到7株芽孢桿菌純菌種，菌種編號(hào)分別為：C10-2、

3、C12、C13、C15、C22、C23和C24。
　?。?）有益微生物的基因鑒定和生物學(xué)功能研究。底泥中篩選出的28株脫氮菌和7株解磷菌，使用引物27F、1492R進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)，結(jié)果顯示：解磷菌中主要包含腸桿菌（Enterobacter sp）、假單胞菌（P. putida）等，脫氮菌中主要包含假單胞菌屬（Pseudomonas）、糞產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等

4、。對(duì)28株脫氮菌進(jìn)行nirK和nirS基因的鑒定，結(jié)果表明YX1-3和YX1-2含nirK基因，TN3-1和TN5-1等5株菌含nirS基因。生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，益生芽孢菌中C24生長(zhǎng)最快,24h菌液OD600達(dá)到3.4；產(chǎn)酶能力：C13分泌蛋白酶最多，C12產(chǎn)淀粉酶最佳，C23和C24產(chǎn)卵磷脂酶能力最強(qiáng)；耐鹽堿性：3％NaCl對(duì)C24無(wú)影響，對(duì)其余菌種抑制率分布在26%~74%，pH10條件下7株菌均未生長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)芽孢菌（除C15）對(duì)金

5、黃色葡萄球菌有抑菌作用，對(duì)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌沒(méi)有抑菌作用。28株脫氮菌在碳源利用上，有18株菌可利用蔗糖和淀粉作為碳源生長(zhǎng)繁殖，包含YY9-2、YX8-2、TN5-1和FX2-2等。
　?。?）NiR酶活檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用。NiR是反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，大多存在于反硝化細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)，以NO2-為底物將其還原最終轉(zhuǎn)化N2離開水環(huán)境。以1ml高效脫氮菌的離心發(fā)酵液或細(xì)胞破碎液作為NiR的粗酶液，經(jīng)等體積1%葡萄糖

6、溶液35℃保溫孵化處理12h后，置于5mg/L NaNO2的10ml酶活測(cè)定體系35℃水浴，4h內(nèi)每60min測(cè)定體系中的NO2--N含量，以單位時(shí)間內(nèi)NaNO2的變化量表示NiR酶活性，Y=（X2-X1）·492.86/ΔT。應(yīng)用方面，NiR活性可以作為菌種反硝化能力的檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)計(jì)算比較比酶活力IY評(píng)價(jià)并篩選出TN1-3（Zobellella denitrificans）、YX8-2（P. putida）和FX7-2（Pseudo

7、monas mendocina）三株產(chǎn)酶能力強(qiáng)的脫氮菌；NiR活性還可作為一項(xiàng)新的水質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，用于評(píng)估水體經(jīng)脫氮的自凈能力。
　?。?）有益微生物的脫氮功能研究。底泥中篩選的28株脫氮菌氨氮和亞硝酸氮降解能力測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)X2-2、FX3-1、FX5-1、YX1-2和YX1-3這5株脫氮菌48h對(duì)初始濃度48mg/L氨氮的降解率達(dá)到30%，其中YX1-2的降解率最高，達(dá)到35%；YY9-2、FX7-2、FX9-1、YX8-2和

8、TN5-1這5株脫氮菌48h內(nèi)3.7mg/L亞硝酸氮的去除率均高于90%， YX8-2的去除率最高，為99.3%。芽孢桿菌的有毒氮素去除實(shí)驗(yàn)中，7株芽孢菌24h內(nèi)對(duì)800mg/L氨氮的去除率均在50%以上，C12的去除率最高，為76.3%，在亞硝酸氮降解率方面，僅有C22在24h內(nèi)對(duì)87mg/L亞硝酸氮去除率為64.4%，其余菌種的降解率低于30%；7株芽孢桿菌以100ppm接種于1.7mg/L NO2—N粗略模擬池塘，72h內(nèi)NO2-