蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法匯總

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定測(cè)定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲(Biuret)法，酚試劑法(Lowry)法及紫外吸收法。[目的要求目的要求]1掌握測(cè)定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2了解染料法、雙縮脲法、Lowry法和紫外吸收法測(cè)定原理。一、染料法一、染料法[實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理]在酸性溶液中染料考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時(shí)考馬斯亮藍(lán)G250顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，吸收高峰從460nm移至595nm。利用這個(gè)原理

2、可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢(shì)，因?yàn)樗僮骱?jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，染料蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強(qiáng)。本法的缺點(diǎn)是：對(duì)于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白氨基酸組成有較大差異的蛋白質(zhì)，有一定誤差，因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。[器材器材]吸量管；試管；721型分光光度計(jì)[試劑試劑]1.標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：配成0.1mgml的溶液。2.待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。3.染料溶液：稱取考馬

3、斯亮藍(lán)G2500.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的濃磷酸100ml，用水稀釋至1000ml混勻備用。[操作步驟操作步驟]1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：試劑(ml)管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nm按上表分別向各支試管內(nèi)加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm波長(zhǎng)處以0號(hào)管調(diào)零測(cè)定各管吸光度值（A）。以吸光度值為縱

4、坐標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品測(cè)定：混勻，37℃水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。1～5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測(cè)得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測(cè)定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。[注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)]1雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO45H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO45H2

5、0之比不低于3∶1，加入KI作為抗氧化試劑。2雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。4黃疸血清、嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。[思考題思考題]1雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么其它還有什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量2請(qǐng)用雙縮脲法，設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的定量方法(除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外)。三、酚試劑法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量三、酚試劑法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量（改良（改良L

6、owryLowry法）法）[實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理]蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色化合物（雙縮脲反應(yīng)），同時(shí)使肽鏈展開，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鎢酸、鉬酸同時(shí)失去1個(gè)，2個(gè)或者3個(gè)氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)顏色（最大吸收峰波長(zhǎng)為745～750nm反應(yīng)式一）其藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比，由此可測(cè)出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時(shí)蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能使