表達載體的構(gòu)建方法及步驟

1、表達載體的構(gòu)建方法及步驟一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一個合格質(zhì)粒的組成要素：（1）復制起始位點i即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。（2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如AmpKan（3）多克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段（4）PE啟動子增強子（5）Terms終止信號（6）加poly（A）

2、信號可以起到穩(wěn)定mRNA作用選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。載體選擇主要考慮下述3點：【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增基因表達，選擇合適的克隆載體表達載體?！?】.載體的類型：（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選?。?。如10kb第一步：首先看i的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核真核穿梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標記，如抗性，決

3、定使用什么篩選標記。（1）Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr可以阻止四環(huán)素進入細胞。（3）camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。（4）ne（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長那霉素衍生物）失活（5）hygr使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點以外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因

4、以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇世K。第六步：啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號（1）啟動子－