蛋白質含量測定方法比較

1、蛋白質含量測定主要有五種方法，分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍法。這五種方法各有特點，優(yōu)缺點明確。凱氏定氮法蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質換算系數(shù)，即得蛋白質含量。因為食品中除蛋白質外，還含有其它含氮物質，所以此蛋白質稱為粗蛋白。優(yōu)點：重現(xiàn)性好

2、，是目前分析有機化合物含氮量常用的方法是一種蛋白質測定的經典方法測試結果準確。缺點：操作比較繁復，費時試劑消耗量大。且此法測定的蛋白質含量實際上包括了核酸，生物堿，含氮類脂，卟啉，含氮色素等非蛋白質含氮化合物。雙縮脲定氮法雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子

3、相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。優(yōu)點：較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。此外，進行紫

4、外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭

5、和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點：靈敏度高比雙縮脲法靈敏約100倍。操作簡單，不需要特殊儀器設備。缺點：費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%）