酵母菌遺傳課件

1、酵母菌遺傳,酵母菌概述,酵母菌：一種單細(xì)胞真菌，屬于兼性厭氧菌；個(gè)體形態(tài)有球狀、卵圓、橢圓、柱狀和香腸狀等。酵母菌具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體等，酵母菌雖屬于真核微生物，同時(shí)又具有原核生物的某些特征，例如形成菌落特征與細(xì)菌相似，生長速度快等。1996年完成釀酒酵母全基因組的測序，是當(dāng)時(shí)完成測序的最大基因組，也是真核生物中第一個(gè)被測序的生物。,,,一、酵母菌的基因組和染色體二、酵母線粒體基因

2、組及其遺傳三、酵母菌中的質(zhì)粒四、酵母基因表達(dá)的調(diào)控五、接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換六、酵母菌的載體系統(tǒng)七、酵母雙雜交系統(tǒng),第一節(jié) 酵母菌的基因組和染色體一、酵母菌的基因組,1. 釀酒酵母的單倍體細(xì)胞含有16條染色體，總長度為12068kb，其中第Ⅰ條染色體最短(230kb )，第Ⅳ條染色體最長(1532kb) 。2. 基因組中沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，有間隔區(qū)和內(nèi)含子。3. 釀酒酵母染色體基因組中，有5885個(gè)可能是編碼

3、蛋白質(zhì)的ORF，每個(gè)ORF約為1.4kb，而基因間的平均間隔為600bp。（這說明酵母基因比其它高等真核生物基因排列緊密。）4.基因組含有52個(gè)完整的Ty因子（反轉(zhuǎn)座子）。,第一節(jié) 酵母菌的基因組和染色體,1.核小體：DNA和組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）釀酒酵母中無H1（有絲分裂中維持染色質(zhì)的高度超螺旋）2.著絲粒（centromere）:點(diǎn)著絲粒和區(qū)域著絲粒3.端粒(telomere)：末端重復(fù)序列和蛋白質(zhì)4.復(fù)

4、制起點(diǎn)：控制DNA復(fù)制起始的一段DNA序列—ARS ARS若克隆到質(zhì)粒中，可使質(zhì)粒DNA在酵母中自主復(fù)制。 1）ARS的結(jié)構(gòu) A：ACS在所有的ARS都完全相同或相似 ARS B：ACS的3’末端 C：A,1.著絲粒,概念 著絲粒是真核細(xì)胞染色體DNA上的一段特殊序列。在有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)，紡錘絲與著絲粒結(jié)合，將染色體拉向細(xì)胞的兩極。主要類型：點(diǎn)著絲粒（著絲粒序列很短

5、釀酒酵母） 區(qū)域著絲粒（著絲粒序列較長 脈胞菌、果蠅、人 ）,1.著絲粒,在釀酒酵母中，所有染色體的CEN序列的長度均大于130bp，由5′→3′依次分為 CDEⅠ、CDEⅡ和CDEⅢ三個(gè)區(qū)。 CDEⅠ和CDEⅢ是兩個(gè)共有序列，位于兩側(cè)，中間是CDEⅡ，CDEⅡ的核苷酸序列中（A+T）含量超過90％，所以容易彎曲。,2.端粒,端粒是真核生物線性染色體兩端的特殊DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，

6、這種復(fù)合體結(jié)構(gòu)是由 DNA重復(fù)序列和與之相結(jié)合的蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的。 在大多數(shù)生物中，端粒DNA只是由幾個(gè)堿基組成的DNA重復(fù)單位通過串聯(lián)重復(fù)而形成，長度從20bp到幾個(gè)kb不等。 釀酒酵母端粒DNA的長度約為300bp，其DNA重復(fù)單位為： 5′C1-3A 3′G1-3T,,在大多數(shù)生物中，端粒DNA的旁邊

7、還常含有由中等重復(fù)序列組成的DNA。在酵母中，與端粒相連的DNA有兩類：,,X 保守性較差，長度為0.3~3.7kb，存在于大多數(shù)染色體上。,Y' 高度保守，長度為6.7kb,釀酒酵母中2/3的端粒含有1~4個(gè)拷貝的Y'。,X和Y'作用：非必需，對端粒的穩(wěn)定、染色體斷裂后的修復(fù)以及在減數(shù)分裂中染色體聯(lián)會方面都起輔助作用。,,3.復(fù)制起點(diǎn) 酵母的復(fù)制起點(diǎn)是指染色體上控制DNA復(fù)制起始的一小

8、段DNA序列，通常稱為自主復(fù)制序列(autonomously replicatory sequence，ARS)。 自1979年首次發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的ARS以來，已在釀酒酵母中約有400個(gè)ARS， ARS/40kb。但這些ARS的使用頻率不同，變動在0-100%之間。,（1） 自主復(fù)制序列ARS的結(jié)構(gòu)釀酒酵母中，ARS是長度為100~200bp、富含 A T 的DNA片段。根據(jù)其在質(zhì)粒中的穩(wěn)定性，可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：其中A和

9、B最為重要,（2）ARS-結(jié)合蛋白釀酒酵母復(fù)制的起始可能是通過蛋白質(zhì)與ARS相互作用而引起的 。與ARS結(jié)合的蛋白有六種，分子質(zhì)量分別：120kD、72kD、62kD、57kD、53kD和50KD,這些蛋白以復(fù)合物的形式存在并與ACS結(jié)合，這種蛋白質(zhì)復(fù)合體稱為起始識別復(fù)合物（ORC）。ORC與A區(qū)結(jié)合，也與B區(qū)結(jié)合。另外，Abflp也是一種主要的ARS結(jié)合的蛋白，能提高復(fù)制效率。,,（3） ARS啟動染色體復(fù)制的活性釀酒酵母基因

10、組中約有400個(gè)ARS，但并不是所有的ARS在原染色體上都具有自主復(fù)制活性?？墒?，將這些染色體上的ARS克隆到質(zhì)粒上后，卻都有自主復(fù)制活性。從使用的時(shí)序來看，可分為兩類：位于不同位點(diǎn)表現(xiàn)的活性不同，靠近端粒的ARS，一般不表現(xiàn)活性。,第二節(jié) 酵母線粒體基因組及其遺傳,線粒體是真核細(xì)胞重要的代謝中心之一。線粒體DNA(mtDNA)編碼線粒體自身所需的rRNA、tRNA以及某些蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素和ATP酶等。 （一）呼吸缺陷突變株

11、酵母可以通過呼吸和發(fā)酵這兩種代謝形式來取得能量，在有氧條件下呼吸，缺氧條件下發(fā)酵。小菌落突變株：吖啶黃處理野生酵母后，出現(xiàn)很多在好氣條件下生長緩慢的突變株。（缺少細(xì)胞色素a、b以及細(xì)胞色素c氧化酶） 分離性小菌落：染色體上基因發(fā)生了突變 類型 中性小菌落：完全丟失了線粒體DNA 抑制性小菌落：丟失了部分線粒體DNA,,（二）酵

12、母線粒體基因組的物理圖譜及其特點(diǎn),1.酵母線粒體DNA是周長約26μm的環(huán)狀DNA分子，其大小為84kb。2.絕大多數(shù)的mtDNA中沒有重復(fù)核苷酸序列。3.線粒體是半自主性的，能復(fù)制并傳遞給后代，還能轉(zhuǎn)錄所編碼的遺傳信息，合成線粒體某些自身特有的多肽，但是并非自給自足。,第三節(jié) 酵母菌中的質(zhì)粒,（一）2μm質(zhì)粒 環(huán)狀且周長為2μm的DNA雙鏈、50－100個(gè)拷貝，只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個(gè)蛋白質(zhì)基因（REP1、REP2、REP

13、3和FLP），不賦予宿主細(xì)胞遺傳表型，屬于隱蔽質(zhì)粒。,1.特征：質(zhì)粒上有兩個(gè)600bp長的反向重復(fù)序列（IR），這兩個(gè)IR中間由一個(gè)大單一區(qū)域和小單一區(qū)域所間隔。2.在兩個(gè)IR上各有一個(gè)FRT(專一性重組位點(diǎn))，由于這兩個(gè)FRT間的相互重組，產(chǎn)生A型和B型兩種互變異構(gòu)型的混合質(zhì)粒。,（二） 嗜殺現(xiàn)象,1963年，Bevan和Makower發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中某些菌株可產(chǎn)生毒素而殺死其他酵母的現(xiàn)象。 嗜殺株（killer）：產(chǎn)生毒素的

14、菌株 敏感株：對毒素敏感的菌株 中性株：既不產(chǎn)毒素又不敏感的菌株 該特性由兩種具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞遺傳因子----雙鏈線狀RNA(dsRNA)決定的，它們通常以蛋白質(zhì)外殼包裹著的粒子狀態(tài)存在于細(xì)胞之中，不具有體外侵染的特性。也稱為類病毒顆粒（virus-like particle）. 分類：L型類病毒、M型類病毒 L-dsRNA:編碼自身和M型的蛋白外殼和RNA聚合酶

15、 M-dsRNA：編碼殺傷毒素蛋白，分泌到細(xì)胞外。,第四節(jié) 酵母基因表達(dá)的調(diào)控,根據(jù)其性質(zhì)，真核基因調(diào)控分兩類:1、瞬間調(diào)控（可逆性控制）2、發(fā)育調(diào)控（不可逆性控制）,上游激活序列（upstream activating sequence UAS）TATA元件轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)沉默子,一、酵母基因的啟動元件（順式作用元件）,二、酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（反式作用蛋白）,通用轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合在TATA序列附近，包括TFII-

16、A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、TFII-F等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（結(jié)合在啟動子上游） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白由兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：（1）DNA結(jié)合區(qū)（2）轉(zhuǎn)錄激活區(qū),1.TATA 區(qū)結(jié)合蛋白,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物由 TATA 元件附近序列及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)等順式作用元件和多種通用轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶Ⅱ組成。 成環(huán)假說,2.GAL4轉(zhuǎn)錄因子和gal基因的表達(dá)調(diào)控,酵母半乳糖代謝酶基因（gal）表達(dá)可以被生長條件所控制。半

17、乳糖通過轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖后進(jìn)入糖酵解途徑而被酵母利用。 gal基因的轉(zhuǎn)錄是被嚴(yán)格調(diào)控的。gal1基因、gal7基因、gal10基因和gal12基因在沒有半乳糖的條件下不表達(dá)，而在半乳糖存在條件下表達(dá)水平提高約1000 倍。,3.GCN4轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 GCN4能特異結(jié)合到許多氨基酸合成酶基因的啟動子調(diào)控元件上，激活基因的轉(zhuǎn)錄。,HAP1 HAP2和HAP3都是轉(zhuǎn)錄因子，控制酵母細(xì)胞色素c基因CYC1和CYC7的轉(zhuǎn)錄。

18、CYC1 UAS 由 UAS1 和UAS2 兩個(gè)位點(diǎn)組成。 UAS1 與葡萄糖抑制時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān) UAS1和UAS2共同作用 是乳糖去阻遏時(shí)基因轉(zhuǎn)錄所必需的。,4.HAP1 HAP2和HAP3,酵母細(xì)胞的單倍體類型是由接合型基因（MATα和MATa）決定的。MATα編碼α1和α2兩個(gè)蛋白調(diào)控因子，它們決定α型細(xì)胞的表型。MATa編碼a1蛋白，控制a型細(xì)胞的表型。,5.α1、α2和a1調(diào)節(jié)蛋白,一、釀酒酵母的生活史二、釀酒

19、酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制 1、a和α單倍體細(xì)胞 2、接合信息素信號的傳遞 3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用三、接合型基因的轉(zhuǎn)換 1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu) 2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,一、釀酒酵母的生活史,一、釀酒酵母的生活史二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制 1、a和α單倍體

20、細(xì)胞 2、接合信息素信號的傳遞 3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用三、接合型基因的轉(zhuǎn)換 1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu) 2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,酵母的有性生殖取決于兩個(gè)單倍體細(xì)胞的接合型，其接合型的“性別” 是由其本身的遺傳物質(zhì)所決定的，是穩(wěn)定的遺傳特征。,1、a和α單倍體細(xì)

21、胞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,α細(xì)胞分泌的α-因子與a細(xì)胞中ste2基因編碼的受體蛋白結(jié)合。同樣，a細(xì)胞分泌的a-因子與α細(xì)胞中ste3基因編碼的受體蛋白結(jié)合。,2、接合信息素的傳遞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,2、接合信息素的傳遞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,2、接合信息素的傳遞,在釀酒酵母中，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子Ste12

22、是一個(gè)控制不同發(fā)育過程起始的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。 在單倍體細(xì)胞中，Ste12通過阻遏單倍體細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和促進(jìn)與接合有關(guān)的必需基因的表達(dá)，從而促進(jìn)接合所需的生理反應(yīng)，最終形成合子； 在雙倍體細(xì)胞中，Ste12是細(xì)胞生長所必需的。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用,釀酒酵母的單倍體細(xì)胞a和α兩種接合型, 分別是由MATa和MATα基因決定的。

23、 MATα編碼α1和α2兩種調(diào)節(jié)蛋白。α1蛋白激活αsg基因群的表達(dá)，而α2是一種同源結(jié)構(gòu)域蛋白, 阻遏性地抑制asg基因群的表達(dá)，因此, 在MATα細(xì)胞中表現(xiàn)出α型細(xì)胞的表型性狀。 MATa也編碼a1和a2兩種蛋白，但a2蛋白的功能不清楚，與接合作用的調(diào)控?zé)o關(guān)；a1蛋白在單倍體細(xì)胞中不起作用，只在二倍體細(xì)胞中起作用。在a型細(xì)胞中,asg基因群可組成型地表達(dá), 表現(xiàn)出a型細(xì)胞的表型性狀。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,

24、二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用,（1）當(dāng)a和α細(xì)胞接合形成a/α二倍體細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的接合型基因以MATa/MATα二倍體的形式存在。 (2)MATα生成的α2蛋白抑制asg基因群的表達(dá)，同時(shí)α2和a1蛋白協(xié)同作用阻礙α1和所有hsg基因群的表達(dá)。 (3)因此細(xì)胞不再具備接合能力, 而是激活二倍體特異性基因的轉(zhuǎn)錄, 同時(shí)信息素的信號系統(tǒng)也終止。 (4)二倍體細(xì)

25、胞在營養(yǎng)條件不良時(shí),進(jìn)行減數(shù)分裂以產(chǎn)生子囊孢子。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),a可以轉(zhuǎn)變成α型, α型也可以轉(zhuǎn)變成a型。這兩者可以相互轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象稱為接合型轉(zhuǎn)變(mating type conversion)。 這些品系帶有顯性等位基因 HO 并頻繁地改變它們的交配型（常常每代改變一次），帶有隱性等位基因 ho 的品系有一個(gè)穩(wěn)定的交配型，其交配型改變的頻率僅約 10 -6 。

26、 接合型轉(zhuǎn)換的存在表明所有的細(xì)胞都含有稱為MATa和MATα所需要的信息，但是只有類型獲得表達(dá)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),為什么會出現(xiàn)接合型的轉(zhuǎn)變呢？ 接合型基因MAT的兩側(cè)有兩個(gè)沉默基因座位HMLα和HMLa，它們與MAT位于同一染色體上，與MAT的距離分別是180kb和150kb。HML和HMR含有與MAT相同的交配型基因，但只有MAT座位的基因才組成型的表達(dá)

27、，而HMLα和HMRa不表達(dá)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),1.在兩個(gè)沉默基因座位HML和HMR的兩側(cè)各有抑制表達(dá)的沉默子，位于HML上游的沉默子（EL）和下游的沉默子（IL），位于HMR上游的沉默子（ER）和下游的沉默子（IR）。沉默子對基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用，即抑制基因的表達(dá)。 2.SIR1、SIR2、SIR3、SIR4這幾種蛋白通過與E位點(diǎn)的相互作用而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

28、E的行為類似于負(fù)增強(qiáng)子，可在離啟動子2.5kb遠(yuǎn)距離行使功能，且無方向性?；钴S基因上無E位點(diǎn)和I位點(diǎn)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,接合型的轉(zhuǎn)換說明發(fā)生了基因轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由于受體位點(diǎn)MAT的Yα或Ya被位于同一染色體上的HMRα中的Ya或HMLα中的Yα序列所取代而完成的。 這種基因轉(zhuǎn)換是由HO內(nèi)切酶所引起的。HO內(nèi)切酶只對MAT的Y區(qū)右側(cè)的Y-Z交界處進(jìn)行識別和切割，HO內(nèi)

29、切酶引起的雙鏈斷裂，激發(fā)了MAT序列的轉(zhuǎn)換過程，這種轉(zhuǎn)換實(shí)際上是一種重組過程。,第六節(jié) 酵母的載體系統(tǒng),根據(jù)其功能可分為三大類： 克隆載體 表達(dá)載體 分泌載體轉(zhuǎn)化方法：電轉(zhuǎn)化法 醋酸鋰法,一、克隆載體,1、酵母整合型載體（YIp) 2、酵母附加體質(zhì)粒載體（YEp） 3、酵母菌復(fù)制載

30、體（YRp) 4、酵母著絲粒載體（YCp) 5、酵母人工染色體（YAC),1．酵母整合型載體（YIp）,1. 這類載體只含有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn), 不能在酵母菌中自主復(fù)制。但可以與酵母染色體進(jìn)行同源重組, 以低頻率整合到酵母細(xì)胞染色體上。 2. 整合位點(diǎn)數(shù)取決于載體中的互補(bǔ)基因序列數(shù)。通常以單拷貝存在, 少數(shù)發(fā)生多位點(diǎn)整合。 3. 大部分YIp質(zhì)粒含酵母菌選擇標(biāo)記(如HIS3、LEU2、URA3等

31、)。 4.這種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子很穩(wěn)定,可在無選擇條件下培養(yǎng)很多代而不丟失,但其轉(zhuǎn)化率很低,2．酵母附加體質(zhì)粒載體（YEp）,載體的拷貝數(shù)多（50~100）、穩(wěn)定性好，是酵母遺傳工程中應(yīng)用最廣泛的載體系統(tǒng)，常用于酵母菌中的一般基因克隆和基因表達(dá)的研究。,3．酵母菌復(fù)制載體(YRp),Yrp含有酵母自主復(fù)制序列（ARS），可作為染色體外因子復(fù)制并保留下來。這類載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝數(shù)也高，但在減數(shù)分裂和有絲分裂中不穩(wěn)定而使群體內(nèi)的拷貝數(shù)變化

32、很大。,4．酵母著絲粒載體(YCp),1.含有酵母染色體的著絲粒（CEN），在細(xì)胞分裂時(shí)新復(fù)制的質(zhì)粒均等分離，每一個(gè)細(xì)胞得到1~3個(gè)質(zhì)粒，故拷貝數(shù)很低，但很穩(wěn)定。2.由于YCp的高穩(wěn)定性和低拷貝數(shù)，因此這類質(zhì)粒適合做亞克隆載體和構(gòu)建酵母基因組DNA文庫3.還可用于檢測有絲分裂中染色體倍性變化和分析鑒定酵母基因突變等研究。,YAC載體的使用：,一些哺乳動物的基因大于100kb超過了大腸桿菌載體系統(tǒng)的承受范圍，但正好在YAC載體的范圍之

33、內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，YACs可以在哺乳動物中表達(dá)，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能?！　ACs在構(gòu)建基因文庫中非常重要，最高容量的大腸桿菌質(zhì)?？梢圆迦?00kb的片斷，對于人的基因文庫需要30000個(gè)克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些類型可以攜帶1400kb片段，可以使人類基因文庫的克隆數(shù)降至6500個(gè)。雖然，”mega-YACs”存在著不穩(wěn)定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。但是，YACs在大規(guī)模的測

34、序中是非常有用的。,YAC(yeast artificial chromosome)是人工構(gòu)建的具有酵母染色體功能的人工染色體載體。1983年Murray等人將酵母的著絲粒、自主復(fù)制序列及一些標(biāo)記基因與四膜蟲大核 rDNA末端的端粒連接在一起，共同構(gòu)成了長度為55kb的酵母人工染色體。1987年，美國華盛頓大學(xué)的Burke等人構(gòu)建了能克隆大片段的酵母人工染色體，這是真正意義上的第一代 YAC載體系統(tǒng)。,5．酵母的人工染色體(YA

35、C),酵母的表達(dá)載體包括酵母菌的強(qiáng)啟動子、多克隆位點(diǎn)、終止子。外源結(jié)構(gòu)基因插入多克隆位點(diǎn)的適當(dāng)酶切位點(diǎn)，在強(qiáng)啟動子的調(diào)節(jié)下，外源基因就可進(jìn)行高效表達(dá)。 酵母啟動子分兩大類：第一類是來自編碼解糖酶基因的解糖啟動子，如ADHI、PGK、GAP、ENOI等，這些啟動子能在酵母菌中高水平組成型表達(dá)；第二類是強(qiáng)調(diào)節(jié)啟動子，其中GAL1、GAL7和GAL10是半乳糖調(diào)節(jié)啟動子。。,二、酵母菌的表達(dá)載體(YXp),分泌載體是一種將基

36、因產(chǎn)物分泌到胞外的一類載體。 酵母菌的分泌載體除必須含有表達(dá)載體的啟動子和終止子外，還需要在表達(dá)載體的起始密碼子(ATG)的上游有分泌信號序列。,三、酵母菌的分泌載體(YSp),第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng),1.作用：酵母雙雜交系統(tǒng)是研究酵母體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種方法。2.原理：gal4基因編碼的GAL4是酵母半乳糖代謝酶基因（gal）轉(zhuǎn)錄必需的轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)。GAL4包含兩個(gè)可分割的、功能相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(1)D

37、NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD):：能識別和結(jié)合到啟動子的上游激活序列；(2)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(DNA-AD) ：通過同RNA聚合酶相互作用，啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開時(shí)仍各自具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性。,（一） 酵母雙雜交系統(tǒng)原理,在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將兩個(gè)待測蛋白X和Y分別于DNA-BD結(jié)構(gòu)域和DNA-AD結(jié)構(gòu)域融合。

38、 1.如果 X和Y沒有相互作用，不能激活UAS下游報(bào)告基因的表達(dá)。 2.如果X和Y存在相互作用，可激活UAS下游報(bào)告基因的表達(dá)。,（一） 酵母雙雜交系統(tǒng)原理,用酵母雙雜交系統(tǒng)研究兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，首先將X和Y的基因分別克隆到AD和BD兩個(gè)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒，然后將兩個(gè)重組質(zhì)粒共同導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)酵母細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)兩個(gè)融合蛋白。 因此，完整的酵母雙雜交系統(tǒng)由三部分組成：AD載體、BD載

39、體和帶有報(bào)告基因的酵母菌株。,將AD結(jié)構(gòu)域克隆到另一個(gè)酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建成和 pGAD-C（X）質(zhì)粒, 稱為目標(biāo)質(zhì)粒（Pray plasmid）,將BD結(jié)構(gòu)域克隆一個(gè)酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建成pGBD-C(X)質(zhì)粒，稱為誘餌質(zhì)粒（Bait plasmid）,,SC-Try-Lue-His- X-gal,,,,,,,,,,,能生長，且為蘭色菌落,1.酵母PJ69-4A菌株本身無報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性。2.這些啟動子都受完整GAL4蛋白的誘導(dǎo)后

40、可以高效表達(dá)。另外，該菌中的gal4基因被缺失，這樣報(bào)告基因的表達(dá)完全依賴于表達(dá)載體所提供的GAL4 AD 結(jié)構(gòu)域和BD 結(jié)構(gòu)域在空間的互相靠近。,,,不能生長，即使生長也是白色菌落,SC-Try-Lue-His- X-gal,,,,,,1. 有很高的靈敏性，可以檢測到生物化學(xué)方法檢測不到的相較弱及暫時(shí)的蛋白質(zhì)間的相互作用。2.  酵母雙雜交系統(tǒng)是直接在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合蛋白，減少了人工純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。3.&

41、#160; 酵母雙雜交系統(tǒng)是在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，蛋白質(zhì)相對于體外更可能處于天然狀態(tài)，因此更能代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。4.  融合載體可以進(jìn)行各種修飾以利于后續(xù)工作中確認(rèn)蛋白質(zhì)間的相互作用。如BD和AD載體各自帶上不同的表面抗原標(biāo)記以方便地用這些抗原的抗體來鑒定蛋白質(zhì)。,二、酵母雙雜交系統(tǒng)的特點(diǎn),三、 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,酵母雙雜交系統(tǒng)主要用在兩個(gè)方面：①研究兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用；②篩選與已知蛋白質(zhì)