解淀粉芽孢桿菌降解角蛋白機制的初步研究.pdf

1、角蛋白(keratin)屬于硬性蛋白，主要存在于動物的表皮組織中，例如毛發(fā)，鱗片，羽毛，蹄，角等結構中。具有抗化學試劑和水解酶攻擊的性質。角蛋白因其難以降解的特性常被當作農(nóng)工業(yè)副產(chǎn)物被丟棄，造成了很大的浪費。角蛋白降解菌是一類能夠直接利用角蛋白作為碳氮源的微生物，角蛋白降解菌能夠分泌多種角蛋白降解相關的酶類，如角蛋白酶，蛋白酶以及二硫鍵還原酶，這些酶類與菌體生長所產(chǎn)生胞聯(lián)氧化還原系統(tǒng)一起作用于角蛋白，促使角蛋白變性，并使之降解。

2、　　本論文比較了10株解淀粉芽孢桿菌菌株的角蛋白降解能力及胞外蛋白分泌情況，發(fā)現(xiàn)Bacillus Amyloliquefaciens ACCC19735，可以在24h內(nèi)將羽毛完全降解。結合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS的技術手段初步確定了13個角蛋白降解相關的酶類，包括9個蛋白水解相關酶:4個S8家族的蛋白酶(proteinase)，2個M28家族的肽酶(peptidase)，1個M42家族的肽酶(peptidase)，1個

3、M32家族的羧肽酶(carboxypeptidase M32)，1個M17家族亮氨酰氨肽酶LAP(leucyl aminopeptidase);3個NADH代謝相關的酶:二氫硫辛酸脫氫酶DID(dihydrolipoyldehydrogenase)和NAD(P)H依賴型氧化還原酶NADO(NAD(P) H-dependent oxidoreductase);1個氨基酸代謝相關的酶:尿刊酸水合酶UHY(urocanate hydratas

4、e)。
　　通過全基因組測序獲得了該菌基因組精細圖，結合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS技術以及生物信息學分析獲得了15個角蛋白降解相關基因序列，包括kerk, pam, pam1，pam2, mep, bap，bap2,bap3，serp，cap, lap, nado, did1，did2，uhy。其中kerk基因已被證明是角蛋白降解過程中的關鍵酶。其他多個基因均未有過角蛋白降解的相關研究。
　　本研究用大腸桿菌

5、誘導表達型載體pET28a構建了pET28a-pam，pET28a-pam2兩個表達載體，并成功實現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達，測定了這兩個氨肽酶的性質，其中氨肽酶PAM與底物作用的最適溫度是45℃，最適pH是7.5，對leu-pNA的比活力為745U/mg，PAM2的最適作用溫度為50℃，最適pH為8.0，對Leu-pNA的比活為896U/mg，通過與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液上清的協(xié)同實驗，驗證了這兩個蛋白在濃度為10uM的時候，對解淀粉芽孢桿