微生物檢測(cè)方法

1、1992、FDA《細(xì)菌分析手冊(cè)―需氧菌平板計(jì)數(shù)》，或15～300個(gè)（如ISO4833:1991《微生物學(xué)大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)通用指南最大可能數(shù)技術(shù)》）等。菌落計(jì)數(shù)前先觀測(cè)菌落生長(zhǎng)的情況，一般同一稀釋度的平板上的菌落數(shù)應(yīng)相近，不同稀釋度平板上的菌落數(shù)則應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比。蔓延菌落的生長(zhǎng)會(huì)抑制其他菌株的生長(zhǎng)，或者會(huì)覆蓋其他的小菌落，所以最好不要選擇有蔓延菌落生長(zhǎng)的平板作為計(jì)數(shù)平板，但如必須選擇，應(yīng)在記錄中標(biāo)記清楚。如片狀菌落不到平板的一半，而其

2、余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），若只有一條鏈可視為一個(gè)菌落，如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。當(dāng)每個(gè)稀釋度制備了兩塊平板時(shí)，用所選擇的平板的算術(shù)平均值來(lái)計(jì)算原始樣品中的微生物的含量。樣品的菌落數(shù)等于每克或每毫升的cfu值除以稀釋度。報(bào)告方式：空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)：2.2大腸菌群大腸菌群或稱總大腸菌群是指一群能在37℃條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或

3、兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。符合這些條件的腸桿菌科細(xì)菌主要包括4個(gè)菌屬：埃希氏菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個(gè)種，即大腸桿菌；其次有檸檬酸桿菌屬，其代表種有弗勞地枸櫞酸桿菌；克雷伯氏菌屬，代表種為肺炎克雷伯氏菌；腸桿菌屬，代表種有陰溝桿菌和產(chǎn)氣桿菌。大腸菌群衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群主要來(lái)源于人、畜糞便。大腸菌群是反映食品中是否存在糞便污染的指示菌，食品中有糞便污染，則可推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒

4、和流行病的威脅，同時(shí)也反映出被測(cè)食品對(duì)人體健康存在危害。大腸菌群檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)通常使用GBT4789.32003、SN016892檢驗(yàn)中需了解和注意事項(xiàng)：1.挑選菌落在實(shí)際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在GBT4789.32003檢驗(yàn)方法中規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤，檢出率為最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。2.發(fā)酵管的產(chǎn)

5、氣量在日常工作中，有時(shí)在發(fā)酵倒管內(nèi)有極微小的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸未產(chǎn)氣，但在液面及管壁卻可以看到緩緩上浮的小氣泡。這種情況大腸菌群的陽(yáng)性檢出率能達(dá)到30%50%。所以不能忽視產(chǎn)氣量少的，對(duì)未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。3.抑菌劑大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑可抑制樣品中的—些

6、雜菌，特別是G的生長(zhǎng)，而有利于大腸菌群的生長(zhǎng)和挑選。GBT4789.32003中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，SN016892中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉（月桂基）作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。2.3金黃色葡萄球菌邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些

7、，外觀可能粗糙并干燥。3.1.5血漿凝固酶試驗(yàn):吸取1，4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加人培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物o.5ml.，振蕩搖勻，置36℃士1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。3.2直接計(jì)數(shù)方法3.2.1吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行10倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度稀釋液1m

8、L，分別加入三塊BairdParker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL0.3mI.0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分多不易吸收，可將平板放在36℃士10C1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36℃士1℃培養(yǎng)。3.2.2在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個(gè)菌落，分別接種血平板，36℃士10C24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。3.2.3菌落計(jì)數(shù):將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加

9、，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。四鑒定試驗(yàn)（1）血漿凝固酶試驗(yàn)：本試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的重要試驗(yàn)血漿凝固酶通常以兔血漿為最好，避免使用檸檬酸抗凝的血漿，以EDTA抗凝兔血漿為最好。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)免血漿于8mmX100mm試管內(nèi)充分混合，置36士1℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。試驗(yàn)

10、中需同時(shí)做已知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。SN01721992中明確規(guī)定對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗(yàn)如耐熱核酸酶試驗(yàn)等加以證實(shí)。(2）觸酶試驗(yàn)：挑取菌落置于清潔玻片上，滴加3%H2O21～2滴，1min產(chǎn)生大量氣泡為陽(yáng)性。(3）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：多數(shù)致病性葡萄球菌菌株發(fā)酵甘露醇。(4）耐熱核酸酶試驗(yàn)：方法在SN01721992中附錄C。(5)SPA的檢測(cè)：SPA能與免抗羊紅細(xì)胞血清中的IgG的Fc段結(jié)合，使致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生凝集，A

11、蛋白的存在是金黃色葡萄球菌的特征。(6）新生霉素敏感試驗(yàn)：每片含5μg，抑菌環(huán)＞16mm者為敏感，16mm者為耐藥。五腸毒素的測(cè)定方法在GBT4789.102003中。當(dāng)食品中檢出金黃色葡萄球菌時(shí)，表明食品加工處理衛(wèi)生條件較差，并不一定說明該食品導(dǎo)致了食物中毒。但當(dāng)食品中未分離出金黃色葡萄球菌時(shí)，也不能證明食品中不存在葡萄球菌腸毒素。2.4沙門氏菌沙門菌屬分類屬腸桿菌科，是腸桿菌科中最復(fù)雜的菌屬，是一種重要的腸道致病菌，可從人和世界各地