測量蛋白質(zhì)含量的方法

1、蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法(Kjedahl）、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradfd)。其中Bradfd法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10~20倍Biuret法靈敏100倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。1.1.凱氏定氮法凱氏定氮法11原理凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣

2、品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨，氨又與—酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。12特點(diǎn)凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。該凱氏定氮法適用范圍廣泛，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測定，干擾少，干擾是非

3、蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）測定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。費(fèi)時(shí)太長，通常810個(gè)小時(shí)，靈敏度低，測定范圍是0.21.0mg。2.2.雙縮脲法雙縮脲法21原理雙縮脲(NI3C0NHC0NH是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)

4、。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。2.2特點(diǎn)雙縮脲法中樣品的取用量對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響.采用05g樣品，40mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響。可快速測定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡便，干擾物min之間，顏色的穩(wěn)定性最好，顏色深淺隨蛋白質(zhì)不同而變化該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干

5、擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色，靈敏度高，測定范圍是15ug。速度快，515min。此法的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradfd法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用y一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質(zhì)的測定