聚乳酸降解菌的選育及其解聚酶研究.pdf

1、隨著塑料制品的廣泛應(yīng)用，帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題能源危機(jī)。人們逐漸認(rèn)識(shí)到了生物可降解塑料應(yīng)用的必要性。目前在世界范圍內(nèi)都在廣泛的提倡和推廣生物可降解塑料的使用。聚乳酸(PLA)由于其優(yōu)良的理化性質(zhì)，被公認(rèn)為最具應(yīng)用前景的生物降解塑料。但即使是生物降解塑料，自然狀態(tài)下不是短時(shí)間內(nèi)就能完全降解的，因此對(duì)以PLA為代表的生物降解塑料的生物降解研究是十分必要的。
　　本研究從活性污泥和實(shí)驗(yàn)室保存菌種中篩選到了3株能夠在以PLA為唯一碳源的

2、培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株。通過(guò)菌體形態(tài)特征、菌落培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)考察以及16SrDNA序列比對(duì)，將菌株DS04-T鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株，DS04-W鑒定為Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌);DS0701鑒定為纖維單胞菌屬(Cellulomonas)菌株。其中Pseudomonas sp.DS04-T不具有水解明膠能力且具有酯酶活力，而其他兩株菌株DS04-W和DS0701具有明膠水解能力

3、并不具有酯酶活力?？紤]到已見PLA生物降解酶的報(bào)道中多為蛋白酶，而酯酶報(bào)道相對(duì)較少，故選擇菌株DS04-T為后續(xù)研究對(duì)象。
　　結(jié)合單因素考察和正交試驗(yàn)分析，優(yōu)選出利用菌株DS04-T液體發(fā)酵PLA解聚酶的最適培養(yǎng)條件如下:將保存于斜面培養(yǎng)基的菌種接種于裝有100mL乳化PLA液體培養(yǎng)基(pH8.5)250mL三角瓶中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3d，制備種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液按6％(V/V)接種量于裝有100mL乳化P

4、LA液體培養(yǎng)基(pH8.5)的250mL三角瓶中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)3d。在此條件下獲取的粗酶液的酶活力為0.167±0.04U/mL。
　　菌株DS04-T發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、Q Sepharose Fast Flow、Phenyl Sepharose6 FastFlow以及Sephacryl S-100 HR等一系列的純化后，一種分子量為34kDa的PLA解聚酶LIP被純化出來(lái)。該P(yáng)LA解聚酶的最適pH和溫度分別

5、為8.5和50℃。該降解酶還能夠降解三油酸甘油酯、PHB和PCL等酯類化合物。Na+和K+能夠激活該降解酶活性，而Zn2+，Mg2+，Cu2+和Fe2+會(huì)抑制該酶的活性。另外EDTA對(duì)該降解酶的活性也有明顯的抑制。通過(guò)分子生物學(xué)手段完成了PLA解聚酶LIP基因的克隆，但是未能實(shí)現(xiàn)該P(yáng)LA解聚酶在E.coli中的有效表達(dá)。采用數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析工具對(duì)PLA解聚酶LIP進(jìn)行了序列分析以及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
　　另外通過(guò)鳥槍法篩選到了另外一

6、個(gè)PLA解聚酶基因pME，該基因與Pseudomonasmendocina全基因組文庫(kù)(CP000680)中的一個(gè)protein of unknown function DUF1486的基因序列一致，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了其在E.coli中的有效表達(dá)。純化獲得的重組酶的分子量為19.2 kDa。其最適pH和溫度分別為8.5和60℃。K+、Ca2+和Ni2+能夠增強(qiáng)該重組酶的活性，而Na+、Zn2+、 Mg2+、cu2+、Fe2+、Mn2+和C