免疫組化染色常見問題及解釋

1、一、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。一、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。在免疫組化最后結(jié)果的判斷時(shí)，?？梢姷骄鶆蛞黄乃品翘禺愋匀旧默F(xiàn)象，經(jīng)多方研究認(rèn)為，它是一種假性非特異性的染色。因?yàn)槟[瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴(kuò)散彌散，腫瘤細(xì)胞無限制的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)過速，導(dǎo)致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用，可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì)，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。

2、另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時(shí)的固定所引起的。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會(huì)自溶，抗原就會(huì)擴(kuò)散，這是一非常普通的常識(shí)，但要做好卻是極不容易。標(biāo)本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時(shí)間，在這段時(shí)間里，有的抗原就可以發(fā)生擴(kuò)散。雖然已浸入了固定液，但標(biāo)本較大，固定液的量又不足，當(dāng)然由于固定液的滲透需要時(shí)間，當(dāng)滲入到組織之中時(shí)，中間的細(xì)胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴(kuò)散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當(dāng)切除后標(biāo)本較大，

3、雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達(dá)到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，當(dāng)固定液發(fā)揮作用時(shí)，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達(dá)到免疫組織化學(xué)染色的要求，對(duì)于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應(yīng)將其剖開，早取材，早固定。二、組織脫水必須徹底干凈二、組織脫水必須徹底干凈組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時(shí)間內(nèi)脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不

4、足，導(dǎo)致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復(fù)操作，造成年人力物力的浪費(fèi)，造成病理報(bào)告的延期發(fā)出等。因此，對(duì)取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外，即平整、外觀好看，還要求適中。三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的切片，對(duì)切片的質(zhì)量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)

5、象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí)，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引起混淆。四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。免疫組織化學(xué)染色前的前期準(zhǔn)備工作，就是必須對(duì)新的載玻片進(jìn)行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認(rèn)為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用

6、，這是一種錯(cuò)誤的想法。新出廠的載玻片，表面復(fù)蓋著開一層油脂樣的物質(zhì)，如果不加以處理，對(duì)切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí)甚至過夜，然后取出，經(jīng)自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達(dá)2小時(shí)以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyltriethoxysilane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無水乙醇洗2次，烘干即

7、可使用。五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。于破壞抗原。應(yīng)用于免疫組化染色的切片。由于整個(gè)過程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理，如抗原修復(fù)時(shí)抗原修復(fù)液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復(fù)沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達(dá)十幾小時(shí)。因此，對(duì)切片的質(zhì)量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤加入非免疫動(dòng)

8、物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認(rèn)為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分無特異性地結(jié)合（如膠原）。由于這種非特異性結(jié)合，將導(dǎo)致標(biāo)記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標(biāo)記的抗體無特異性結(jié)合。以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.必須選擇合適的抗體以及對(duì)作適當(dāng)?shù)谋４婧团渲?。九?/p>

9、選擇合適的抗體九、選擇合適的抗體至今為止，應(yīng)用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當(dāng)中又可分為兩種類型。1.濃縮型抗體根據(jù)近幾年來使用的情況認(rèn)為，它有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處：①可作為各種疾病檢測(cè)的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時(shí)很長(zhǎng)時(shí)間才遇到一例，這就給抗體的應(yīng)用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時(shí)購(gòu)買，則需較長(zhǎng)的

10、時(shí)間，這樣就會(huì)延誤診斷。實(shí)踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測(cè)抗體。當(dāng)購(gòu)買抗體后，根據(jù)檢測(cè)病例的數(shù)量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟?zāi)し馄饋恚冢?0℃的低溫冰箱中保存，臨用時(shí)取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。②成本低，價(jià)格較便宜。它與即用型的抗體相比較，價(jià)格要便宜好多，如以某公司2002年2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價(jià)格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以

11、每張切片所需抗體為50ul計(jì)，可標(biāo)記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價(jià)格150元，可標(biāo)記30例，每例一抗體需5元。③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復(fù)雜。對(duì)于新購(gòu)入的濃縮型的抗體，使用時(shí)必須將稀釋為工作液，才能使用，對(duì)于從未用過的抗體，還必須實(shí)驗(yàn)其實(shí)際的稀釋度，因?yàn)楦鞣N抗體，廠家都做了相應(yīng)的稀釋度的實(shí)驗(yàn)，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對(duì)抗體的稀釋度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如1:100.1:75.1:50.

12、1:25等，如果結(jié)果在1：50上是最佳結(jié)果，這就是最佳的稀釋點(diǎn)，如果在這范圍內(nèi)找不出最佳稀釋點(diǎn)，則應(yīng)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)直到找出最佳稀釋點(diǎn)為止。④需要配置各型號(hào)的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。⑤需要具備一定的英語水平，因?yàn)闈饪s型的抗體多為進(jìn)口試劑，其使用書都以英文為主，其中涉入抗體的來源，適應(yīng)讓稀釋對(duì)什么組織或細(xì)胞可起反應(yīng)等。2.即用型抗體。近幾年來，免疫組化技術(shù)應(yīng)用的推廣，即用型抗體的應(yīng)用越來越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來的使用，認(rèn)為它有許多