第一節(jié) 種子制備

1、?第四章第四章種子制備與菌種保藏種子制備與菌種保藏?第一節(jié)第一節(jié)種子制備（種子制備（Inoculumdevelopment）定義：由保藏的菌種開始，經(jīng)過逐級擴大培養(yǎng)，最后獲得供生產(chǎn)車間發(fā)酵罐接種的的足夠數(shù)量和優(yōu)質質量的種子。生產(chǎn)菌種的必備條件：生產(chǎn)菌種的必備條件：1生長快：2對環(huán)境條件要有比較大的承受能力3遺傳表現(xiàn)型要穩(wěn)定，不易退化4菌種要純幾個概念幾個概念種子罐級數(shù)種子罐級數(shù)：種子在種子罐中需擴大培養(yǎng)的次數(shù)。發(fā)酵級數(shù)：發(fā)酵級數(shù)：種子罐

2、的級數(shù)加一。接種量接種量：放罐的種子罐的培養(yǎng)液體積除以接種后培養(yǎng)液的體積的百分數(shù)。種齡：種齡：生產(chǎn)種子的培養(yǎng)時間。一斜面種子的制備斜面種子的制備1.斜面種子：斜面種子：在試管或扁瓶內(nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面上生長的菌種培養(yǎng)物。2.制備流程：制備流程：3.制備過程注意事項制備過程注意事項(1)瓊脂要完全浸沒在營養(yǎng)液內(nèi)用量1.0%2.5%(2)營養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物；(3)裝量掌握在斜面頂端不超過試管或扁平長度的23；(4)滅菌后垂

3、直放置至稍冷后再斜放，以減少冷凝水(5)微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入3.質量檢查質量檢查(1)外觀檢查(2)無菌檢查(3)搖瓶生產(chǎn)能力檢查4.影響斜面種子質量的因素影響斜面種子質量的因素(1)原材料質量，水質，培養(yǎng)基pH，(2)滅菌條件，(3)接種量，(4)培養(yǎng)室溫度、濕度、通風、(5)培養(yǎng)時間，(6)有害氣體或揮發(fā)物（培養(yǎng)室內(nèi)不要安紫外燈）(7)冷藏條件?二、米粒種子（米孢子）、米粒種子（米孢子）?1.米孢子：米孢子：

4、將霉菌或放線菌接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時間后產(chǎn)生的分生孢子。?2.米孢子制備工藝流程米孢子制備工藝流程?3.制備過程注意事項制備過程注意事項（1）浸泡時間及加營養(yǎng)液量應掌握在滅菌后米粒熟透但不粘連；（2）分裝量應掌握在平鋪后有23粒米的厚度（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培養(yǎng)前期應經(jīng)常搖動米粒，使微生物在米粒表面生長均勻，氣生菌絲及孢子長成后不再搖動。（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%20%甘油浸泡保存?4.質

5、量標準質量標準（1）無雜菌污染（2）孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高（3）生產(chǎn)能力高(4)真空干燥后含水量小于8%5.影響質量的因素及控制影響質量的因素及控制（同前）?三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同米粒種子）三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同米粒種子）四、搖瓶種子四、搖瓶種子1.搖瓶種子搖瓶種子:將斜面種子或米孢子接種于錐形搖瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子。2.制備流程制備流程:3.制備過程注意事項制備過程注意事

6、項?培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量應較斜面豐富，以確保一定的營養(yǎng)菌體生長量；能保持生長過程中pH穩(wěn)定。?培養(yǎng)基裝量適當，以保證良好的通氣并與發(fā)酵罐通氣條件相適應；參考裝量為4050ml250ml瓶，6080ml500ml瓶，90110ml750ml瓶，120150ml1000ml瓶；如果是厭氧培養(yǎng)，則裝量應增加一倍以上；3)滅菌時要注意不要讓蒸汽冷凝水打濕或粘污培養(yǎng)基在瓶塞或紗布上4）注意搖床轉速，轉速越快，偏心距越大，通氣越好。經(jīng)常檢查，皮帶松弛

7、時要緊一緊。5）注意搖床中心與邊緣、上層與5070℃）12年?7冷凍干燥管保存（冷凍干燥管保存（lyophilizationfreezedrying)?收集菌種滅菌脫脂牛奶或馬血清作為懸浮介質?滅菌安瓿管預凍真空凍干密封，?4℃冰箱，保存35年?適用于一切微生物的保存?細胞10%20%甘油作為懸浮介質?分裝入無菌聚丙烯管預凍置液氮內(nèi)（196℃），?保存510年?適用于所有微生物、動物和植物細胞的保存?8液氮管保存液氮管保存(stagei

8、nliquidnitrogen)?9、基因工程菌的保藏、基因工程菌的保藏?由載體質粒等攜帶的外源由載體質粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質粒片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質粒復制子。質粒基因通常為宿主細胞生長非必需。復制子。質粒基因通常為宿主細胞生長非必需。?一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。?當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于

9、攜帶質粒的細胞群體的極有用的當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協(xié)調。制與染色體復制的協(xié)調。?我們建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。我們建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第三章第三章滅菌滅菌(sterilizatio

10、n)滅菌：指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設備中所有生命物質的技術或工藝過滅菌：指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設備中所有生命物質的技術或工藝過程。程。第一節(jié)第一節(jié)滅菌的原理及方法滅菌的原理及方法一幾種常見的滅菌方法幾種常見的滅菌方法1化學物質滅菌化學物質滅菌原理：藥物與微生物細胞中的成分反應，使蛋白原理：藥物與微生物細胞中的成分反應，使蛋白質變質變性酶失活。性酶失活。常用的滅菌劑常用的滅菌劑:使用范圍：使用范圍：器皿、雙手和實

11、驗室、無菌室的環(huán)境滅菌，器皿、雙手和實驗室、無菌室的環(huán)境滅菌，不能用于培養(yǎng)基滅菌不能用于培養(yǎng)基滅菌2.輻射滅菌輻射滅菌原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學反應造成菌體死亡。原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學反應造成菌體死亡。常用：紫外線、常用：紫外線、X射線和射線和γ射線。射線。?使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌?3干熱滅菌干熱滅菌?原理：利用高溫對微生物有氧化、蛋白質變性和電解

12、質濃縮作用而殺滅微生物。原理：利用高溫對微生物有氧化、蛋白質變性和電解質濃縮作用而殺滅微生物。?常用方法：灼燒和電熱箱加熱，常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140180℃12小時小時?使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌?4濕熱滅菌濕熱滅菌?原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質易變原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質易變性。性。?常用方法：常

13、用方法：水煮常壓滅菌：水煮常壓滅菌：100℃飽和蒸汽滅菌：一般飽和蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘分鐘?使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設備滅菌使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設備滅菌。?5過濾除菌過濾除菌?原理：利用微生物不能透過濾膜除菌。原理：利用微生物不能透過濾膜除菌。?方法方法:0.01~0.45?m孔徑濾膜，孔徑濾膜，?使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。?二.濕熱滅