微波誘變乳酸高產菌選育及淀粉廢水發(fā)酵制乳酸工藝研究.pdf

1、針對目前淀粉工業(yè)廢水處理與資源化以及微生物誘變育種技術中存在的問題，基于分子生物學和微波輻照技術，本文進行了用于淀粉工業(yè)廢水資源化處理的乳酸高產菌微波誘變育種技術及相關基礎研究。建立微波誘變選育高產乳酸菌的技術方法，并設計研制了相關實驗裝置，進行乳酸高產菌株的選育；采用生理生化和分子生物學方法對突變菌種進行表征，深入探討微波誘變乳酸菌的過程和機制，考查微波場中影響高產乳酸菌選育的主要因素及影響規(guī)律，同時，對玉米淀粉工業(yè)廢水用于發(fā)酵制備乳

2、酸工藝進行了研究，并將活性炭纖維（ACF）作為固定乳酸菌載體引入發(fā)酵體系，建立了ACF的HNO3-Fe(Ⅲ)改性方法，選擇315型陰離子交換樹脂對發(fā)酵液中的乳酸進行分離提取。
　　本研究采用干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus casei subsp.）X1-12作為原始出發(fā)菌種，自行設計一種功率連續(xù)可調水循環(huán)冷卻式微波輻照育種裝置，用以抵消微波輻照時產生的熱效應，在低功率微波條件下，對干酪乳桿菌X1-12進行誘變處理

3、，在微波功率400W，輻照時間3min的誘變條件下，篩選得到一株突變株W4-3-9，L-乳酸產量為115.8g/L，比出發(fā)菌株提高了58.0％，連續(xù)遺傳10代，產酸性狀穩(wěn)定。通過對微波輻照前后乳酸菌細胞表面形態(tài)和遺傳物質DNA形貌的AFM觀察對比可知，微波輻照前乳酸菌表面有明顯凸起，而輻照后乳酸菌表面光滑，且遺傳物質DNA有明顯的開環(huán)和斷裂情況。進一步對出發(fā)菌株X1-12和突變株W4-3-9進行了AFLP DNA指紋圖譜分析，聚丙烯酰胺

4、凝膠電泳結果顯示出差異條帶，并對d21差異帶進行測序，在GenBank中進行BLAST序列類似性檢索，得出該差異序列與乳酸脫氫酶序列相似，說明微波輻照后乳酸脫氫酶的酶切位點發(fā)生了變化。
　　將選育的高產L-乳酸菌種W4-3-9應用于淀粉工業(yè)廢水為原料制備乳酸工藝中，其結果表明：玉米浸泡廢水與工藝廢水體積配比為3:7、葡萄糖添加量70g/L、初始pH6.8、接種量5%、在溫度37℃下厭氧發(fā)酵72h，L-乳酸產量可達62.28g/L，

5、并且發(fā)酵過程對廢水的COD有45%的去除，NH4+-N去除率75%。
　　對淀粉廢水中的微生物進行平板稀釋法分離，初步鑒定廢水中存在酵母菌、霉菌、葡萄球菌、芽孢桿菌四類主要微生物。研究微波輻照對淀粉廢水培養(yǎng)基殺菌條件，達到培養(yǎng)基細菌總數(shù)為0cfu/mL時，微波功率為500W，輻照時間100s。廢水培養(yǎng)基中總糖、還原糖、蛋白質營養(yǎng)成分滅菌后損失率為：11.76%、18.77%和7.42%，優(yōu)于高壓蒸汽滅菌的營養(yǎng)成分損失。
　　

6、實驗選擇315型陰離子交換樹脂對發(fā)酵液中的乳酸進行分離提取，通過吸附等溫線實驗及上柱條件與洗脫條件優(yōu)化，最終確定最佳上柱流速為1.5BV/h、上柱pH1.9、洗脫劑為去離子水、洗脫流速為1BV/h。在實現(xiàn)乳酸與乙酸、檸檬酸、丙酮酸及葡萄糖等良好的分離基礎上，乳酸純度從原發(fā)酵液中的72.4%提高到85.3%，從吸附到洗脫，全過程中乳酸提取率為79.2%。
　　采用固定化菌體發(fā)酵法，研究ACF載體影響乳酸菌固定化的影響因素。實驗用濃H

7、Cl、H2SO4、HNO3及FeCl3對ACF表面進行改性，并對改性前后的ACF進行XPS射線衍射表征和表面菌膜厚度掃描電鏡觀察，HNO3-Fe(Ⅲ)協(xié)同改性后單絲菌膜厚度為40μm。ACF表面酸性含氧官能團增加，表面正電荷也增加，改性后ACF表面特性能很好地促進乳酸菌的吸附固定，固定乳酸菌的ACF載體用于發(fā)酵過程，發(fā)酵時間縮短到48h，L-乳酸產量68.6g/L較無載體發(fā)酵的L-乳酸量增加了6.4g/L，同時為后序乳酸發(fā)酵液分離提供了