四氫呋喃的微生物降解研究.pdf

1、具有廣泛用途的四氫呋喃在國(guó)民經(jīng)濟(jì)各個(gè)領(lǐng)域的使用日益擴(kuò)大，隨之進(jìn)入環(huán)境的量日益增多，其溶劑特性和致癌性對(duì)于環(huán)境生態(tài)的損害風(fēng)險(xiǎn)也在日益增加。本論文圍繞四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)的微生物降解這一主題，對(duì)THF高效降解菌篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、降解基因克隆和利用THF降解菌反應(yīng)器處理含四氫呋喃廢水等多個(gè)方面內(nèi)容開(kāi)展了研究，結(jié)果分述如下：
　　 (1)四氫呋喃降解菌的篩選鑒定
　　 通過(guò)采集多處環(huán)境樣品并經(jīng)一年

2、馴化富集，從混合樣品中篩選到1株THF降解紅球菌YYL(Rhodococcus sp.YYL).初步研究表明，該菌株對(duì)THF耐受性達(dá)到了200mM，遠(yuǎn)高于報(bào)道菌株；THF濃度為20mM的液體培養(yǎng)基中，102h內(nèi)可降解THF達(dá)100％，因此具有進(jìn)一步研究利用價(jià)值。同時(shí)分離獲得了2株與其伴生的芽孢桿菌Bacillus cereus和Bacillusaquimaris。
　　 (2)四氫呋喃降解條件優(yōu)化
　　 文獻(xiàn)報(bào)道THF降

3、解條件基本采用了其它菌株培養(yǎng)方法，因此通過(guò)優(yōu)化，THF降解速率可進(jìn)一步提高。采用Plackett-Burman和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，篩選出了對(duì)Rhodococcussp.YYL生長(zhǎng)和THF降解具有顯著促進(jìn)作用的三種微量元素，優(yōu)化了THF降解無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中主要組分的濃度。最終獲得了最佳THF降解培養(yǎng)基組成為：NH4CI1.80g/L，K2HPO4·3H2O0.81g/L，酵母膏0.06g/L， MgSO4·7H2O0.40g/L， Zn

4、SO4·7H2O0.006g/L、FeSO4·7H2O0.024g/L，初始pH8.26.經(jīng)優(yōu)化后Rhodococcus sp.YYL的生長(zhǎng)速率和THF降解速率較第一個(gè)報(bào)道的THF降解紅球菌高5倍左右，提高到了0.0892 h-1 and137.60 mg THFh-1·g干重，而且優(yōu)化后培養(yǎng)基在組成上也更加簡(jiǎn)單，因此更具實(shí)際應(yīng)用于THF廢水處理的可行性。
　　 (3)THF降解單加氧酶基因簇克隆
　　 紅球菌是第一個(gè)報(bào)

5、道能夠降解THF的微生物菌株，目前還沒(méi)有相關(guān)降解基因的報(bào)道。本文根據(jù)報(bào)道的Pseudonocardia sp. K1中THF降解單加氧酶基因序列，采用COnsensus-DEgenerate Hybrid oligonucleotide Primer(CODEHOP) PCR和染色體步移法——熱不對(duì)稱(chēng)交互式PCR完成了A亞基的完整序列擴(kuò)增。又根據(jù)擴(kuò)增序列和Pseudonocardia sp。K1中THF降解單加氧酶基因簇序列設(shè)計(jì)了一致性

6、引物，擴(kuò)增了長(zhǎng)為10255bp的單加氧酶基因簇。開(kāi)放閱讀框分析和Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)Rhodococcus sp.YYL的THF降解多組分單加氧酶基因簇中基因表達(dá)方向和排列順序均與Pseudonocardia sp. K1一致，而且各亞基的相似性均在94％以上，表明該基因簇在不同菌株之間相對(duì)保守；但在單加氧酶與醛脫氫酶基因之間被插入了一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因。對(duì)各亞基氨基酸序列的分析表明，A亞基可能是一個(gè)跨膜蛋白，推測(cè)這是難以離體檢測(cè)到該單加氧酶活

7、性的重要原因。進(jìn)一步對(duì)該單加氧酶各個(gè)亞基氨基酸序列和對(duì)應(yīng)菌株16S rDNA序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，Rhodococccus sp.YYL和Pseudonocardia sp。K1中THF降解多組分單加氧酶進(jìn)化距離趨近于0，而兩者在分類(lèi)地位上卻相對(duì)較遠(yuǎn)，因此進(jìn)一步提供了該單加氧酶是可能通過(guò)水平轉(zhuǎn)移引起的證據(jù)。
　　 (4)分離THF降解菌株反應(yīng)器應(yīng)用研究
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，廢水中THF濃度大于>160mM時(shí)，活性污泥中過(guò)

8、氧化氫酶、脲酶、脫氫酶、磷酸酶、蛋白酶活性均受到抑制，DGGE研究結(jié)果表明微生物多樣性也明顯降低，導(dǎo)致污泥處理有機(jī)廢水的效能降低，在一個(gè)周期內(nèi)，有機(jī)碳不能被完全分解.平板計(jì)數(shù)觀察到，隨著THF濃度增加，活性污泥中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌數(shù)量顯著減少，而THF對(duì)放線菌影響較小.在長(zhǎng)期接觸情況下，10mM THF即可抑制過(guò)氧化氫酶、脲酶、脫氫酶、磷酸酶、蛋白酶活性，尤其是脫氫酶，幾乎完全被抑制.DGGE研究表明，受THF廢水影響的活性污泥生物多樣性

9、指數(shù)從1.424降低到了0.823.所有毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明THF排放將對(duì)活性污泥性能造成非常顯著的不利影響，因此THF廢水治理應(yīng)該受到重視。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和篩菌結(jié)果，目前已知的THF降解菌株較少，而且很多活性污泥中并不存在或者難以馴化獲得降解THF的高活性污泥用于THF廢水處理。而采用生物強(qiáng)化手段是切實(shí)可行的辦法.本文以鎮(zhèn)海煉化廠曝氣池活性污泥為載體，構(gòu)建了用于THF降解菌Rhodococcus sp.YYL定植的SBR反應(yīng)

10、器，研究Rhodococcus sp.YYL在反應(yīng)器中定植條件結(jié)果表明該THF降解菌在反應(yīng)器內(nèi)的定植需要共同存在Bacillus cereus和Bacillus aquimaris以幫助或協(xié)同其創(chuàng)造良好的共生微生境，這為該降解菌的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 Rhodococcussp.YYL成功定植的反應(yīng)器，經(jīng)優(yōu)化后連續(xù)進(jìn)水條件下可高效處理進(jìn)水濃度為20mM的THF廢水，THF去除率達(dá)到100％。同時(shí)表明Rhodococcus