紫外可見分光光度計的結(jié)構(gòu)、工作原理與應用

1、紫外可見分光光度計紫外可見分光光度計原理是：分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團的信息。可以用標準光譜圖再結(jié)合其它手段進行定性分析。根據(jù)LambertBeer定律：A=εbc，（A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)b為液池厚度，c為溶液濃度）可以對溶液進行定量分析。你可以用紫外可見分光光度計測定定三種農(nóng)藥的波長在某溶液中的最大、最小吸收波長。配

2、制溶液－在光譜檢測項下進行－調(diào)整檢測光譜范圍及速度－－掃描光譜圖－－吸光度最大處對應波長為最大吸收波長，吸光度最小處對應的波長為最小吸收波長。1.光源燈2.濾光片3.球面反射鏡4.入射狹縫5.保護玻璃6.平面反射鏡7.準直鏡8.光柵9.保護玻璃10.出射狹縫11.聚光鏡12.試樣室13.光門14.光電管.分光光度計工作原理:由光源燈(1)發(fā)出連續(xù)輻射光線經(jīng)濾光片(2)和球面反射鏡(3)至單色器的入射狹縫(4)聚焦成像光束通過入射狹縫(4

3、)經(jīng)平面反射鏡(6)到準直鏡(7)產(chǎn)生平行光射至光柵(8)上色散后又以準直鏡(7)聚焦在出射狹縫(10)上形成一連續(xù)光譜由出射狹縫選擇射出一定波長的單色光經(jīng)聚光鏡(11)聚光后通過試樣室(12)中的測試溶液部分吸收后光經(jīng)光門(13)再照射到光電管(14)上.調(diào)整儀器使透光度為100%再移動試樣架拉手使同一單色光通過測試溶液后照射到光電管上.如果被測樣品有光吸收現(xiàn)象光量減弱放大器處理將光能的變化程度通過數(shù)字顯示器顯示出來.可根據(jù)需要直接在

4、數(shù)字顯示器上讀取透光度(T)吸光度(A)或濃度(C).基本操作:(1)通電儀器自檢預熱20min(2)用鍵設置測試方式:透射比(T)吸光度(A)已知標樣濃度方式(C)和已知標樣濃度斜率(K)方式光度法.所使用的儀器叫作紫外分光光度計.2.1.2原理因為許多化合物的分子結(jié)構(gòu)中存在共軛雙鍵在200～400nm的紫外光區(qū)具有吸收光的特性所以無需進行顯色反應便能直接測定.2.1.3應用常用于對蛋白質(zhì)和核酸進行定性定量測定.蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸

5、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基在波長280nm處具有最大吸收峰.故常用波長280nm處的吸光度測定蛋白質(zhì)的濃度.2.1.4特點(1)組成核酸的堿基也含有共軛雙鍵其最大吸收峰的波長在260nm處.但在280nm處也有一定的光吸收對蛋白質(zhì)的測定有一定的干擾作用.若分別測定280nm和260nm處的吸光度可通過經(jīng)驗公式消除核酸對蛋白質(zhì)測定的影響.(2)可對微量蛋白質(zhì)(1～10gL)不需顯色進行直接定量測定.因此操作簡便而且可回收樣品.此外

6、鹽類在280nm處無光吸收少量鹽類也不會影響測定結(jié)果.(3)紫外分光光度法完全符合LambertBeer定律的基本原理.在其它條件保持一致的情況下被測溶液的吸光度與被測溶液的濃度成正比.2.2UV754型分光光度計的結(jié)構(gòu)和工作原理2.2.1儀器結(jié)構(gòu)由光源由光源(鎢燈或氚燈鎢燈或氚燈))單色器單色器試樣室試樣室接受器接受器(光電管光電管))微電流微電流放大器放大器ACAC轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器打印機鍵盤和顯示器等部件組成.微處理機(CPU)通過輸入

7、輸出口(IO)對微電流放大器顯示器和打印機等部件進行控制實現(xiàn)儀器的整體功能.2.2.2工作原理UV754型紫外可見分光光度計光學系統(tǒng)1.氚燈2.鎢燈3.濾光鏡4.聚光鏡5.入射狹縫6.平面7.準直鏡8.光柵9.出射狹縫10.聚光鏡11.試樣室12.光門13.光電管2.2.2工作原理由光源氚燈或鎢燈(1或2)發(fā)出連續(xù)輻射光線經(jīng)濾光鏡(3)和聚光鏡(4)至單色器入射狹縫(5)處聚焦成像再經(jīng)平面反射鏡(6)反射至準直鏡(7)產(chǎn)生平行光射至光柵