單核增生李斯特氏菌檢測概述概述

1、單核增生李斯特氏菌檢測概述,張惠媛2005年6月,內容,簡介李斯特氏菌屬單核增生李斯特氏菌生物學特性流行病學致病性實驗室危害及其預防檢測程序快速檢測方法,李斯特氏菌屬,李斯特氏菌屬（Listeria ）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學研究表明，其分為六個種：單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）無害李斯特氏菌（Listeria innoc

2、ua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌屬的六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。

3、,生物學特性---菌體形態(tài)及染色特征,革蘭氏陽性；小的、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個、成短鏈、細胞彼此連成V形，或成群的細胞沿長軸方向平行排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃以4根周生鞭毛運動，在37℃只有較少的鞭毛或1根鞭毛；無芽孢、無莢膜。,,生物學特性---培養(yǎng)特性,兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2

4、-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。生長溫度范圍為2-42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。,生物學特性---培養(yǎng)特性,在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊

5、脂上，用45°角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。,生物學特性---生化反應,觸酶陽性，氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類，產酸不產氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，V

6、P、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。,生物學特性---血清型,根據菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。,生物學特性---抵抗力,該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長期存活；對堿和鹽抵抗力

7、強，60-70℃經5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min 可殺死此菌；濕熱滅菌（121℃，至少15min）和干熱滅菌（160-170℃，至少1hr）可殺滅該菌，對紫外線和γ射線敏感；該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。,流行病學,分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物

8、很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲,流行病學,據報道，有1-10%的人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%的水產品、5-10%的奶及其產品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。相關食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、發(fā)酵過的生肉制作的香腸、生的和加工過的禽肉、各種生的肉類、生的和煙熏的魚肉。約有85-90%的病例是由被污染的食品

9、引起的。,1996年至1999年，因單核增生李斯特氏菌回收的食品種類（來源：USDA及FDA報告）,致病性及其治療,該病的臨床表現，健康成人個體出現輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成的腦膜炎的致死率可高達70%，敗血癥的死亡率達50%，圍產期或新生兒感染的死亡率超過80%，懷孕期婦女的感染，母親通常能存活下來

10、?？股刂委煟们嗝顾鼗虬逼S青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。,感染人群,感染劑量未知，但與該菌的毒力和易感人群的年齡、免疫狀態(tài)有關。易感者：孕婦/胎兒—圍產期和新生兒的感染；接受皮質激素、抗癌劑治療、器官移植 治療、艾滋病患者等免疫缺損者； 癌癥病人— 尤其是白血病的患者；不太常見的報道—糖尿病、肝硬化、哮喘和潰瘍性結腸炎的患者；年紀較大的人；沒有免疫缺陷的健康的人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌的

11、食品后，也有患病的危險。,致病機理,單增李氏菌的抗原結構與毒力無關，它的致病性與毒力機理如下： 1、寄生物介導的細胞內增生，使它附著及進入腸細胞與巨噬細胞； 2、抗活化的巨噬細胞，單增李氏菌有細菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細胞內的過氧物（為殺菌的毒性游離基團）分解； 3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，有α和β兩種，為毒力因子。,實驗室危害,不是一種普遍的與實驗室相關的傳染病，目前只有少數有報道的案例發(fā)生

12、；直接攝取是最普遍的一種感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度的氣溶膠中，也可通過眼睛和破損的皮膚、粘膜進入體內造成感染。,注意事項,生物安全2級，操作時應有相應的防污染設施，在進行可能產生氣溶膠的操作時，應在生物安全柜內完成；在直接接觸有感染性的材料時，必須穿著實驗服，戴手套和護目鏡；懷孕的婦女應避免接觸傳染物。,操作要求,濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周邊向中心加，在清理之

13、前要留充足的接觸時間（30min）；廢棄：在廢棄前應先采取凈化措施，高壓蒸汽滅菌、化學消毒、焚燒等；儲存：在有適當標記的密封容器內儲存。,檢測程序---增菌,目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、 Fraser肉湯（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buf

14、fered Listeria enrichment broth）,半量Fraser肉湯和Fraser肉湯,具有選擇性和區(qū)別性。加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉靈，與培養(yǎng)基中的鐵離子反應，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用的添加劑一樣 半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10m

15、g/L，吖啶黃12.5mg/L Fraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃的25mg/L,UVM,UVM只有選擇性沒有區(qū)別性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉靈，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反應。,LEB和BLEB,只有選擇性沒有區(qū)別性LEB是在TSB-YE的基礎上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入的丙酮酸鈉，有助于受損細胞的恢復；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反

16、應BLEB是在LEB基礎上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉,檢測程序---分離,分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首選仍然是OXA。分離原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉靈，產生七葉苷，與鐵離子產生顏色反應而，使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagar liste

17、ria、Rapid’L. mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。,OXA平板,單核增生李斯特氏菌 ATCC 1911748h，35℃培養(yǎng),OXA平板,無害李斯特氏菌ATCC 3309048h，35℃培養(yǎng),檢測程序---鑒定,藍色菌落檢驗（Henry illumination）典型運動：相差顯微鏡，輕微旋轉或翻跟

18、頭 動力試驗：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗：穿刺接種血平板硝酸鹽還原試驗：5天，陰性糖發(fā)酵試驗：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其他種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義,動力試驗,,血平板,單核增生李斯特氏菌 ATCC 1911736h，35℃培養(yǎng),血平板,無害李斯特氏菌 ATCC 3309036h，35℃培養(yǎng),血平板,伊氏李斯特氏菌

19、 ATCC 1911924h，35℃培養(yǎng),單核增生李斯特氏菌檢測流程,25g樣品+225ml BLEB基礎（加入丙酮酸鈉）,加入萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮,30℃ 4hr,劃線接種OXA平板,30℃ 24hr和48hr,科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基,,,,,TSA-YE分純,35℃ 24hr-48hr,35℃ 24hr,過氧化氫酶試驗、革蘭氏染色、溶血試驗、糖發(fā)酵試驗（木糖、鼠李糖）,API Listeria,35℃ 24-48hr,報

20、告結果,,,35℃ 18-24hr,,各官方方法比較,,各官方方法比較,紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中分離和鑒定單核增生李斯特氏菌的方法,,,紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中分離和鑒定單核增生李斯特氏菌的方法,,,FDA：李斯特氏菌屬的快速篩選試劑盒,Table 2. Listeria Genus Detection Test Kits Prescribed for Regulatory ScreeningAOAC Official M

21、ethod 993.09. 2000. Listeria in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric deoxyribonucleic acid hybridization method (GENE-TRAK Listeria Assay). (3, 14)AOAC Official Method 994.03. 2000. Listeria monocytogenes

22、in dairy products, seafoods, and meats. Colorimetric monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method (Listeria Tek). (5, 15, 32)AOAC Official Method 995.22. 2000. Listeria in foods. Colorimetric polyclonal enzyme i

23、mmunoassay screening method (TECRA Listeria Visual Immunoassay [TLVIA]). (6, 30)AOAC Official Method 996.14. 2000. Assurance (Polyclonal Enzyme Immunoassay Method). (7, 21)AOAC Official Method 997.03. 2000. Visual Im

24、munoprecipitate Assay (VIP). (8, 22)AOAC Official Method 999.06. 2000. Enzyme Linked Immunofluorescent Assay (ELFA) VIDAS LIS Assay Screening Method. (9, 23),FDA：生化鑒定的替代方法,Vitek Automicrobic Gram Positive and Gram Nega

25、tive Identification cards (bioMerieux, Hazelwood, MO) API Listeria (bioMerieux, Marcy-l'Etoile, France) which does not require an additional CAMP testThe MICRO-IDTM kit (bioMerieux, Hazelwood, MO; 1, 24) permits

26、speciation of Listeria isolates if their CAMP reactions are knownThe Phenotype MicroArray for Listeria (BiOLOG, Hayward, CA) is another recently introduced kit.,FDA：鑒定單核增生李斯特氏菌的試劑盒,Table 3. Test Kits Useful in Confirmi

27、ng Listeria Isolates as Listeria monocytogenes or notAccuProbeTM Listeria monocytogenes culture confirmation test (Gen-Probe, Inc, San Diego, CA)GeneTrak Listeria monocytogenes test kit (Neogen, Lansing, MI)Probeli

28、a Listeria monocytogenes test kit (BioControl, Seattle, WA)VIDAS Listeria monocytogenes test kit (bioMerieux)Transia Plate Listeria monocytogenes (Diffchamb SA, Lyon, France)FDA, SRL application of Niederhauser et

29、al. method for PCR detection and identification of L.  monocytogenes BAX Listeria monocytogenes test. (Qualicon, Inc., Wilmington, DE),單核增生李斯特氏菌檢測快速方法,VIDASVITEKAPI ListeriaBAXTECTA,,VIDAS LMO：單核增生李斯特VI