第二章蛋白質(zhì)分子折疊機(jī)理

1、第二章 蛋白質(zhì)分子折疊機(jī)理,第一節(jié)、概述：蛋白質(zhì)折疊：protein folding結(jié)構(gòu)上：伸展unfolding ? 三維結(jié)構(gòu)功能上：無(wú)活性分子?有活性的分子一、問(wèn)題的提出：1。伸展的蛋白質(zhì)肽鏈如何折疊成有特定的三維結(jié)構(gòu)？2。無(wú)活性的蛋白分子如何折疊成有生物功能的蛋白質(zhì)分子？體外實(shí)驗(yàn)：30年前如何？設(shè)備條件、技術(shù)路線、研究人員不多?，F(xiàn)在情況？已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的活躍的領(lǐng)域。,主要原因：對(duì)于研究生物大分子

2、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。由于蛋白質(zhì)工程研究的需要基因工程研究發(fā)展的需要先進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的應(yīng)用，研究手段的提高。 (1)、二維核磁共振技術(shù)的建立，分辨率高的核磁共振儀的改進(jìn)和完善。 (2)、DNA重組技術(shù)的應(yīng)用為蛋白質(zhì)折疊的研究提供豐富的研究對(duì)象。 (3)、計(jì)算機(jī)的進(jìn)步和應(yīng)用,第二節(jié)、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性一、蛋白質(zhì)變性的基本概念：1。引起蛋白質(zhì)變性的因素： 物理因素、化學(xué)因

3、素2。蛋白質(zhì)變性表現(xiàn)：物理性質(zhì)的改變：化學(xué)性質(zhì)的改變：生物學(xué)性質(zhì)的改變：變性作用：天然蛋白質(zhì)：變性蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)變性：可逆變性：不可逆變性：,3。檢測(cè)蛋白質(zhì)變性的方法：測(cè)定蛋白質(zhì)的比活力以天然蛋白質(zhì)為對(duì)照，測(cè)定蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)的變化 例如：旋光法?旋光度 圓二色性法?橢圓度 紫外差示光譜?消光系數(shù) 粘度法?特性粘度

4、 電泳法?電泳遷移率蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的變化： 例如：側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)性 被蛋白酶水解情況蛋白質(zhì)的抗原性蛋白質(zhì)的溶解度,4。蛋白質(zhì)變性研究簡(jiǎn)史第一階段：變性現(xiàn)象的觀察，吳憲1931年變性理論為代表第二階段：變性與蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的關(guān)系第三階段：分子構(gòu)象的變化研究－X光晶體衍射二、各種變性因素對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響1。溫度：熱變性、可逆與不可逆2。pH：3。有機(jī)

5、溶劑：靜電力、氫鍵、疏水鍵靜電力：改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)、影響離子氛、影響蛋白質(zhì)分子和溶劑間的相互作用,氫鍵：能與蛋白質(zhì)生成強(qiáng)氫鍵的溶劑，不利于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氫鍵形成，而不能與蛋白質(zhì)生成強(qiáng)氫鍵的溶劑，有利于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氫鍵形成。疏水鍵：疏水鍵是一種疏水側(cè)鏈為了避開(kāi)水相而群集在一起的一種相互作用力。有機(jī)溶劑可以降低溶液的極性，破壞蛋白質(zhì)分子中的疏水鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。4。脲、胍等變性劑對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：5。表面變性劑對(duì)蛋

6、白質(zhì)構(gòu)象的影響：長(zhǎng)鏈的脂肪酸、SDS,三、蛋白質(zhì)變性后構(gòu)象的變化：吳憲1931年提出的變性理論：蛋白質(zhì)變性后，肽鏈由原來(lái)緊密有序的構(gòu)象變成松散無(wú)規(guī)的構(gòu)象。1968年Tantord 把變性產(chǎn)物的構(gòu)象概括：高濃度的脲、胍變性的蛋白質(zhì)，呈無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象，若打開(kāi)二硫鍵，變成線狀無(wú)規(guī)卷曲熱、酸堿變性的蛋白質(zhì)，往往保持部分緊密構(gòu)象。高濃度有機(jī)溶劑變性蛋白質(zhì)的螺旋度增大，不存在疏水區(qū),四、復(fù)性：Renaturation概念：變性的蛋白質(zhì)在

7、除去變性因素后，恢復(fù)到天然狀態(tài)的構(gòu)象和生物活性的過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的復(fù)性作用。第三節(jié)：蛋白質(zhì)的折疊：Folding蛋白質(zhì)折疊：探討蛋白質(zhì)由伸展態(tài)(變性)經(jīng)折疊或再折疊(復(fù)性)成天然態(tài)的機(jī)理。探討蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：杜雨蒼：1961年、胰島素A、B鏈的拆開(kāi)、再合并，二硫鍵形成。體外化學(xué)合成胰島素A、B鏈，研究二硫鍵形成的情況,Anfinsen 1961年：核糖核酸酶變性與復(fù)性的情況－4對(duì)二硫鍵被還原后再氧化重組，可以折疊

8、到天然狀態(tài)，恢復(fù)生物功能。一級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的信息全部蘊(yùn)藏于一級(jí)結(jié)構(gòu)之中。 一級(jí)結(jié)構(gòu)含有全部高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊密碼。1979年：Privalov 提出蛋白質(zhì)折疊的 “二態(tài)模型” U(伸展態(tài)) N(天然態(tài))1989年Kuwajima 認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊是逐步發(fā)生的過(guò)程，但未捕捉到中間態(tài)。1992年Dobson 首次報(bào)道蛋白質(zhì)折疊的中間態(tài)，提出 “三態(tài)”模型,,,第四節(jié)、蛋白質(zhì)體外

9、折疊機(jī)理：1。折疊步驟：三態(tài)模型：認(rèn)為蛋白質(zhì)肽鏈從伸展態(tài)(U)經(jīng)過(guò)早期的變化進(jìn)入中間態(tài)(I)，然后再由中間態(tài)過(guò)渡到最終的天然態(tài)。2。折疊過(guò)程的起始點(diǎn)：蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的形狀、大小的不同將影響到側(cè)鏈在三維結(jié)構(gòu)中所在的位置和安排方式；側(cè)鏈的極性的不同決定蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基之間和蛋白質(zhì)與水之間的相互作用的性質(zhì)和強(qiáng)度。,折疊起始點(diǎn)：折疊起始于穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成：變性后部分殘余的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)如某些扭曲、轉(zhuǎn)角作為折疊的“種子”

10、，氨基酸肽鏈圍繞它們形成較穩(wěn)定的緊密的區(qū)域，再進(jìn)一步形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。折疊由疏水倒塌(hydrophobic collapse)開(kāi)始：由于氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的疏水作用引起鏈的倒塌，使得疏水側(cè)鏈集中藏于分子內(nèi)部，極性側(cè)鏈露于表面與水接觸。折疊起始于共價(jià)鍵相互作用的形成：1988年 Oas & Kim (Nature 336,42): 牛胰胰蛋白酶抑制劑；合成；肽鏈片斷；P? (16肽，No.43-58, ?-螺旋), P? (

11、14肽 No.20-33, ?-折疊)；圓二色性測(cè)定肽鏈的構(gòu)象完全伸展(還原態(tài))；當(dāng)30位和51位的二硫鍵連接后，兩條肽鏈形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),3。折疊中間態(tài)：Ptitsyn 研究牛的?-乳清蛋白在熱變性、胍變性時(shí)，蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在著一種相對(duì)穩(wěn)定的具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的緊密球狀物的中間態(tài)，稱(chēng)為熔球態(tài)(melton-globule state)。熔球態(tài)的特征：具有天然態(tài)的一級(jí)結(jié)構(gòu)在分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量較高。三級(jí)結(jié)構(gòu)不完整。

12、熔球態(tài)熱變性時(shí)沒(méi)有溫度躍遷、紫外吸收變化不明顯。,4．折疊途徑：Folding pathway伸展的肽鏈在折疊成天然態(tài)的過(guò)程中，要嘗試所有可能的構(gòu)象，直到形成其天然態(tài)蛋白質(zhì)的構(gòu)象為止。？？蛋白質(zhì)折疊沿著單一的限定的途徑進(jìn)行，每個(gè)分子都按著同樣的限定順序進(jìn)入天然態(tài)。？？蛋白質(zhì)折疊沿著有限的多途徑進(jìn)行，同一種蛋白質(zhì)的不同分子在折疊過(guò)程中可以沿著不同途徑達(dá)到同樣的天然態(tài)，形成天然態(tài)途徑的選擇是有限的。,總結(jié)：體外蛋白質(zhì)的折疊可能是：

13、或者始于疏水倒塌、或者始于穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成、或者始于共價(jià)鍵的相互作用如二硫鍵的形成。在折疊早期階段，可能這三種方式聯(lián)合起作用，接著折疊反應(yīng)可能沿著有限的途徑形成中間態(tài)(如熔球態(tài))。中間態(tài)的結(jié)構(gòu)緊密、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量較高，但缺乏明顯的三級(jí)結(jié)構(gòu)。最后由中間態(tài)進(jìn)入天然態(tài)，此步是蛋白質(zhì)折疊的限速步驟。,第五節(jié)、伴侶蛋白與肽鏈折疊：1．伴侶蛋白及其功能：伴侶蛋白(chaperones) 分子伴侶 (molecular chaperones):

14、輔助蛋白質(zhì)多肽鏈在合成過(guò)程中的正確折疊和寡聚蛋白的組裝。伴侶蛋白存在于細(xì)胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體和細(xì)胞核中功能：能專(zhuān)一與細(xì)胞中非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)相互作用，與合成中的肽鏈結(jié)合，介導(dǎo)各功能域或整個(gè)蛋白質(zhì)分子的正確折疊。能與細(xì)胞液中合成的線粒體及葉綠體蛋白質(zhì)結(jié)合，使其肽鏈保持伸展?fàn)顟B(tài)而被跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)。,在應(yīng)激狀態(tài)下，能與非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)結(jié)合，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露而發(fā)生不可逆的凝集。 2．伴侶蛋白的分類(lèi)：根

15、據(jù)伴侶蛋白的結(jié)構(gòu)，分為幾個(gè)家族；1) Stress-70家族：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：分子量約70 kd，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N-末端結(jié)構(gòu)域高度保守，具有腺苷三磷酸酶ATPase 活性。C-末端結(jié)構(gòu)域保守性差。Stress-70家族的熱休克蛋白Hsp70 在熱休克中的作用，目前研究較廣泛。,功能：Stress-70家族蛋白能識(shí)別和結(jié)合新合成的蛋白質(zhì)肽鏈，使之穩(wěn)定，以防止錯(cuò)誤折疊和聚集。在蛋白質(zhì)合成結(jié)束，就被從Stress-70蛋白上釋放出來(lái)，并折

16、疊成天然態(tài)。從Stress-70蛋白上釋放結(jié)合的肽鏈需要能量，是來(lái)自于Stress-70蛋白結(jié)合的ATP的水解。,2) Chaperonin家族Chaperonin家族蛋白廣泛存在于細(xì)胞中，在熱休克、細(xì)菌感染等都能引起該族蛋白在細(xì)胞內(nèi)增加。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：Chaperonin家族蛋白有兩種氨基酸順序相關(guān)的類(lèi)型，大的叫Chaperonin-60 (cpn-60) 亞基分子量60kd，由17個(gè)相同的亞基組成的；小的叫Chaperonin-10

17、 (cpn-10) 亞基分子量10kd，由7個(gè)亞基組成的。,作用：Chaperonin家族蛋白的作用是促進(jìn)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)肽鏈的折疊或裝配成天然態(tài)，識(shí)別的位點(diǎn)不是靶蛋白的氨基酸順序或天然態(tài)，而是它們的部分折疊的非天然態(tài)，并提供一個(gè)表面或工作臺(tái)面，在其上結(jié)合非天然態(tài)蛋白質(zhì)，然后通過(guò)一系列ATP水解，完成被結(jié)合的非天然態(tài)蛋白質(zhì)的正確折疊或裝配。,伴侶蛋白如何協(xié)助新生蛋白質(zhì)肽鏈正確折疊？Stress-70蛋白的作用是結(jié)合、位點(diǎn)合成的蛋白質(zhì)肽

18、鏈，維持其處于部分的狀態(tài)，一旦合成完成，就將其釋放。這種被釋放出來(lái)的部分折疊的肽鏈立即被Chaperonin家族蛋白所捕捉并催化它正確折疊成天然態(tài)。一個(gè)合成的蛋白質(zhì)肽鏈，可能依賴(lài)于一個(gè)或多個(gè)分子伴侶，或者不同的分子伴侶按前后次序工作，最后導(dǎo)致其折疊成為有特定的三維結(jié)構(gòu)和生物功能的蛋白質(zhì)分子。,3．鈣聯(lián)接蛋白介導(dǎo)糖蛋白肽鏈的折疊：糖蛋白合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，肽鏈一邊合成、一邊糖基化、一邊折疊。糖蛋白的正確折疊與能識(shí)別糖基化狀態(tài)的伴侶蛋白有關(guān)。

19、這種伴侶蛋白需要鈣離子的結(jié)合才能發(fā)揮其功能.稱(chēng)為鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)。鈣聯(lián)蛋白的特征：屬于I型膜蛋白，C-末端位于胞液，有磷酸化位點(diǎn)，N-末端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，能與鈣離子和靶蛋白結(jié)合，介導(dǎo)糖蛋白正確折疊。未折疊或錯(cuò)誤折疊的肽鏈能被葡萄糖基化，含有葡萄糖基的肽鏈能被鈣聯(lián)蛋白識(shí)別和結(jié)合，葡萄糖基被切除，正確折疊的肽鏈不會(huì)再被葡萄糖基化，從而不能被鈣聯(lián)蛋白結(jié)合。鈣聯(lián)蛋白的活力受到鈣離子和磷酸化的調(diào)節(jié)，鈣聯(lián)蛋白與靶蛋白的結(jié)合需要ATP酶

20、作用。,第六節(jié)、生物工程中的蛋白質(zhì)折疊：一、包含體(inclusion bodies)生物工程成就就是要使外源基因在大腸桿菌中成功克隆和表達(dá)。那么表達(dá)產(chǎn)物－蛋白質(zhì)是否具有生物活性是生物工程中一個(gè)必要解決的問(wèn)題。包含體：在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外源基因蛋白質(zhì)是以“變性”的無(wú)活性的蛋白質(zhì)形式存在、沉積于細(xì)胞內(nèi),這種無(wú)定形的蛋白質(zhì)聚體,它們不被如何膜所包圍,稱(chēng)為包含體.包含體的形成實(shí)際上是蛋白質(zhì)折疊中中間態(tài)的“非專(zhuān)一性聚集”。,U

21、 I N伸展態(tài) 中間態(tài) 天然態(tài) A (包含體),,,,,,二、包含體形成的機(jī)理： 蛋白質(zhì)生物合成翻譯產(chǎn)物 蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定構(gòu)象 不穩(wěn)定構(gòu)象可溶性 可溶性

22、 不溶性穩(wěn)定 降解 包含體,,,,,,,,,,三、形成包含體在生物工程中的意義：形成包含體，呈致密的顆粒，不易溶解，易純化。包含體的形成，保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物不被蛋白質(zhì)水解酶降解。包含體成分是正確表達(dá)的肽鏈組成，用變性劑增溶成為可溶性的伸展肽鏈，然后在適當(dāng)?shù)臈l件下折疊成天然有活性的蛋白質(zhì)分子，從而達(dá)到生物工程的最終目的。,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能,要求：選擇某種蛋白質(zhì)或酶理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)功能

23、實(shí)際應(yīng)用分子生物學(xué)研究進(jìn)展或研究概況格式：參考《廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)》包括：題目3#,作者5#,單位專(zhuān)業(yè)學(xué)號(hào)5#、中文摘要小5#、前言、正文、總結(jié)、參考文獻(xiàn)/注明引用編號(hào)、作者全、題目、期刊、年卷頁(yè)。均為5＃，標(biāo)題加黑，大約4000－5000字、A4紙，交稿時(shí)間：11月27日前。交稿方式：Email: chenqx@xmu.edu.cn評(píng)分：分為優(yōu)、良、中；優(yōu)的要交流，每人15分鐘，可以自己推薦優(yōu)等。經(jīng)老師審閱、挑選15－20人上