a淀粉酶高產(chǎn)菌株篩選實(shí)驗(yàn)

1、1a淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定及固定化淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定及固定化枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是aa淀粉酶高產(chǎn)菌株淀粉酶高產(chǎn)菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。其芽孢0.6～0.91.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。廣泛生長(zhǎng)在中性的的

2、含淀粉多的環(huán)境中，如富含淀粉的面粉廠、土壤等。淀粉酶是一種用途極為廣泛的生物催化劑，可應(yīng)用于面包制作業(yè)、淀粉的糖化和液化、紡織品脫漿、造紙、清潔劑工業(yè)、化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的分析和制藥業(yè)等。淀粉酶家族包括α淀粉酶、β淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α淀粉酶為內(nèi)切酶，以無規(guī)則的方式切開淀粉分子內(nèi)部的α1，4糖苷鍵，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一種鈣離子依賴性酶。β淀粉酶從非還原性末端順次切下麥芽糖，為外切酶。葡萄糖淀粉酶是一種作用于α1，4糖苷鍵的外切酶

3、，從非還原糖末端切下葡萄糖分子。a淀粉酶是一種胞外酶，由于酶純化等操作往往導(dǎo)致酶活性和穩(wěn)定性都受影響，而利用細(xì)胞固定化可以很好的解決這一問題，其中α淀粉酶的固定化交聯(lián)法是目前比較理想的方法。另可嘗試探索用一定濃度的凝膠包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交聯(lián)法將枯草芽孢桿菌固定化，使菌體不能流動(dòng)而酶可以存在反應(yīng)液里。凝膠柱底部可選用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反應(yīng)凝膠柱，而產(chǎn)物可以流出?！緦?shí)驗(yàn)一】【實(shí)驗(yàn)一】一、一、a淀粉酶生產(chǎn)菌種的分離與培

4、養(yǎng)、篩選淀粉酶生產(chǎn)菌種的分離與培養(yǎng)、篩選二、【實(shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)枯草芽孢桿菌好氧，最適生長(zhǎng)溫度為32℃PH為7.2，轉(zhuǎn)速為140rmin，接種量為9％，芽孢率生長(zhǎng)最適溫度36℃，最適PH為7.2，最適轉(zhuǎn)速120rmin。在以淀粉為碳源的固體培養(yǎng)基上用劃線法分離純化出產(chǎn)a淀粉酶的菌株，根據(jù)是否可產(chǎn)生透明圈來篩選。透明圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。三、【實(shí)驗(yàn)儀器和材料】1、試劑：0.1%呂氏(Loeffier)美藍(lán)染液配制方法：A液：美藍(lán)(methy

5、leneblue又名甲烯藍(lán))0.3g95%乙醇30ml；B液：0.0l%KOHl00ml?；旌螦液和B液即成，根據(jù)需要可配制成稀釋美藍(lán)液。2、淀粉酶篩選富集培養(yǎng)液（細(xì)菌）淀粉10g、硫酸銨10g、氯化鈉5g、硫酸亞鐵0.5g、磷酸氫二鉀1g、牛肉膏1g，定容1L，調(diào)至pH為7，取300ml分裝9ml于小試管中，高壓蒸汽滅菌于，115℃，20min。3、淀粉酶篩選培養(yǎng)基I（細(xì)菌）淀粉3g、硫酸銨3g、氯化鈉1.5g，用無機(jī)酸堿調(diào)pH值至7

6、.0左右，加蒸餾水定容至300ml，再加瓊脂5.4g，裝入三角瓶，塞上棉塞，用報(bào)紙包扎瓶口。高壓蒸汽滅菌，于115℃，20min，冷卻至5055℃左右時(shí)倒入無菌平皿。4、淀粉酶篩選培養(yǎng)基II（細(xì)菌）淀粉10g、硫酸銨10g、氯化鈉5g、硫酸亞鐵0.5g、磷酸氫二鉀1g、牛肉膏1g，定容1L，調(diào)至pH為7，再加18g瓊脂，取300ml分裝9ml于小試管中，高壓蒸汽滅菌于，115℃，20min。5、器材燒杯、玻璃棒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、吸

7、管、移液槍、漏斗、瓷缸、接種環(huán)、刮鏟、載玻片、顯微鏡、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、蓋玻片四、【實(shí)驗(yàn)步驟】3DNS法測(cè)還原糖法測(cè)還原糖DNS試劑的制備試劑的制備將6.3克DNS和262ml2molL氫氧化鈉，加到500ml含有182克酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加水定容到1000ml，即制成35二硝基水楊酸試劑，貯于棕色瓶中備用。DNS法測(cè)還原糖法測(cè)還原糖葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的

8、繪制分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mgml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml試管中，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2ml，沸水浴加熱2min，流水冷卻，用水補(bǔ)足到15ml刻度。在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。DNS法測(cè)還原糖法測(cè)還原糖樣品的測(cè)定樣品的測(cè)定樣品液適當(dāng)稀釋，使糖濃度為0.11.0mgml，取稀釋后的糖液1.0ml于15ml刻度試管中，加DNS試劑2.0ml，沸水煮沸2min，冷卻后用水補(bǔ)足到15ml刻度，在540nm波

9、長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mgml數(shù)。求出樣品中糖含量。六、【注意事項(xiàng)】1、美蘭染色濃度和時(shí)間嚴(yán)格掌握；2、平板培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，過長(zhǎng)則霉菌長(zhǎng)出?！緦?shí)驗(yàn)二】【實(shí)驗(yàn)二】二、菌株的鑒定二、菌株的鑒定一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)酵母菌的鑒定方法，熟悉使用分子生物學(xué)手段進(jìn)行微生物鑒定。二、【實(shí)驗(yàn)原理】微生物鑒定是科研及生產(chǎn)過程中非常重要的工作?？梢酝ㄟ^菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化分析及分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定。三、【實(shí)驗(yàn)儀器和材料】A、DNA提取需