嘔吐毒素降解菌的篩選鑒定、降解酶的純化及其特性研究.pdf

1、嘔吐毒素又稱脫氧腐鐮刀菌烯醇毒素(DON)，是一種B型單端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于大自然中，容易污染谷物和飼料，給全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人和動(dòng)物攝入一定量被DON污染的谷物會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重的威脅，因此DON的防治研究迫在眉睫。
　　目前關(guān)于DON的脫毒方法主要有物理法、化學(xué)法和生物降解法。

2、其中由于DON的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，物理方法的脫毒效果并不理想，化學(xué)處理法雖然能達(dá)到較好的脫毒效果，但會(huì)引入其他有害物質(zhì)并造成谷物營(yíng)養(yǎng)損失，而生物降解法是通過(guò)篩選自然界中的微生物在溫和條件下降解真菌毒素，將DON轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒物質(zhì)，且不會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)丟失。因此生物降解法被認(rèn)為是去除真菌毒素的最佳方法。
　　本論文采用生物法降解DON，利用苯基環(huán)氧乙烷為唯一碳源從土壤樣品中篩選出一株能夠生物降解DON的菌株，研究其降解機(jī)理，對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)的D

3、ON降解酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，比較降解酶和菌株對(duì)DON的降解效果，并對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析研究。主要工作內(nèi)容歸結(jié)如下:
　　用苯基環(huán)氧乙烷作為唯一碳源，從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的菌株As-W6，其發(fā)酵液可以降解DON，說(shuō)明該該菌株分泌的一種胞外酶可以生物轉(zhuǎn)化DON。對(duì)菌株As-W6進(jìn)行形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、掃描電鏡和分子生物學(xué)鑒定，菌株As-W6生長(zhǎng)初期菌絲為白色絨毛，后變?yōu)辄S綠色，菌絲發(fā)達(dá)且有隔膜，分生孢子串生

4、、呈球形或橢球形，頂囊呈放射狀。提取菌株As-W6的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、送樣測(cè)序后，得到目的基因長(zhǎng)度為531 bp，通過(guò)與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)進(jìn)行Blast序列對(duì)比，菌株As-W6與多種米曲霉同源性均達(dá)到99％。因此可確定菌株As-W6是一株米曲霉。
　　米曲霉As-W6發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過(guò)濾層析純化后得到電泳純的蛋白酶，純化倍數(shù)為

5、86.7倍，回收率為23.2％，經(jīng)過(guò)LC-MS/MS的鑒定，該酶為一種脂肪酶蛋白(ID:DQ489719)，分子量為40810.3 Da，等電點(diǎn)為5.80，包含383個(gè)氨基酸。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該脂肪酶最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間有較好的穩(wěn)定性;Ca2+、Mg2+和Acetone能夠明顯促進(jìn)提高脂肪酶的活性，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對(duì)其有顯著抑制作用;當(dāng)大豆油作為底物時(shí)該脂肪酶的