tgfβ1誘導肺泡上皮細胞間質轉化

1、TGFβ1誘導肺泡上皮細胞間質轉化作者：黃振杰鄭金旭莫凱天蘇石芳作者單位：廣西北海市人民醫(yī)院呼吸科江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸科上海市第八人民醫(yī)院消化科【摘要】目的：通過觀察TGF1誘導下A549細胞出現(xiàn)的細胞形態(tài)學和Ecad表達的變化，探討上皮細胞間質細胞轉化(epithelialmesenchymaltransitionEMT)過程在肺纖維化發(fā)病機制中的作用。方法：體外培養(yǎng)A549細胞，以TGF1進行干預，收集不同時段的細胞，應用熒光實時定

2、量PCR(RTPCR)檢測TGF1干預前后Ecad的mRNA表達變化倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的變化間接免疫熒光觀察Ecad蛋白表達的變化。結果：倒置相差顯微鏡觀察到TGF1干預后A549細胞由鵝卵石狀變?yōu)樗笮?，形態(tài)如同肌纖維母細胞。間接免疫熒光顯示A549細胞的Ecad表達(紅色熒光染色)隨時間延長逐漸減少。RTPCR顯示Ecad的mRNA表達下調(P0.05)。結論：TGF1在體外誘導肺泡上皮細胞向間質細胞轉化肺泡上皮細胞間質轉化

3、是肺纖維化的重要發(fā)病機制之一?！娟P鍵詞】轉化生長因子1A549細胞上皮細胞間質轉化肺纖維化Abstract：ObjectiveByobservingthecellularmphologychangestheexpressionofEcadafterA549cellsweretreatedwithtransfminggrowthfact1(TGF1)，toinvestigatetheroleofepithelialmesenchymalt

4、ransition(EMT)inthepathogenesyofpulmonaryfibrosis.MethodA549cellsculturedinvitroweretreatedbyTGF1thenharvestedatdifferenttimepointstoassaymRNAexpressionofEcadbyrealtimePCR(RTPCR)befeafterA549cellsbeingtreatedbyTGF1.Cellu

5、larmphologychangeswereobservedbyphasecontrastmicroscope.ProteinexpressionofEcadbyindirectimmunofluescence.ResultsAfterbeingtreatedbyTGF1，A549cellswereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscopetoturnfrompebbleshapetofusifm

6、shape，amyofibroblastlikemphology.IndirectimmunofluescenceshowedproteinexpressionofEcadreducedastimewentby(redstain).ThemRNAexpressionofEcadwasdownregulatedinRTPCR(P0.05).ConclusionTGF1inducedEMTofalveolarepithelialcellsi

7、nvitrosuggeststhatEMTofalveolarepithelialcellsmightbeoneoffundamentalmechanismsofpulmonaryfibrosis.KeyWds:TransfminggrowthfactA549cellsEpithelialmesenchymaltransitionPulmonaryfibrosis特發(fā)性肺纖維化(IPF)是最常見的肺間質疾病也是肺間質纖維化的主要原因。多

8、數(shù)肺間質疾病病因不明其發(fā)病機制目前也未完全闡明。傳統(tǒng)觀點認為各種損傷因素損傷肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞，炎癥細胞浸潤，細胞因子失衡，肺實質損傷后繼發(fā)肺間質細胞增殖過度修復導致纖維化。國外有文獻報道IPF是一種涉及異常創(chuàng)傷愈合的功能紊亂，進行性的上皮損傷和(或)激活可能處于纖維形成和間質細胞增殖的核心位置，這種作用是不依賴于炎癥的[12]。肺泡上皮細胞(AECs)不僅僅是作為發(fā)病的促動因素，它們本身就可以通過一個叫做上皮細胞間質轉化(

9、epithelialmesenchymaltransition，EMT)的過程獲得間質細胞表型而作為成纖維細胞和肌纖維母細胞的重要來源。在這個新的模式中，肺泡上皮應該被看作纖維化的關鍵環(huán)節(jié)之一，它作為一個多能的干細胞具有相當?shù)目伤苄裕軈⑴c到交替的途徑中：上皮再生修復正常的肺泡結構，凋亡，或者通過EMT形成纖維化。本研究通過用TGF1誘導A549從肺泡上皮細胞向間質細胞轉化，進一步探討肺泡上皮細胞在肺纖維化發(fā)病中的作用為闡明肺纖維化發(fā)病

10、的分子生物學機制及尋求新的治療方法提供TGF1組相比，A549細胞在加入TGF1后其上皮細胞標志物Ecad的mRNA表達在24小時內總體呈現(xiàn)下調趨勢，在第24h時間點上最明顯(P0.01)，在第3h時間點上出現(xiàn)一個短暫反彈(P0.05)。3討論EMT是一種完全分化的上皮細胞經(jīng)歷細胞表型改變轉化成完全分化的間質細胞的過程，通常轉化成成纖維細胞和肌纖維母細胞[3]。EMT過程很久以來一直被認為在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤的細胞轉分化中起主導作用。外

11、胚層在早期形成原間質的發(fā)育中經(jīng)歷了EMT過程。次級上皮通過間質細胞上皮轉化產生。這些次級上皮然后分化形成完全成熟的上皮，或者經(jīng)歷第二輪EMT形成各種各樣的間質細胞和結締組織細胞，例如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞和成纖維細胞[4]。近年來發(fā)現(xiàn)EMT可以發(fā)生于多種生理、病理過程，不僅在胚胎發(fā)育、腫瘤轉移級聯(lián)反應的早期階段起重要作用，還促進傷口愈合和多種器官的纖維化。正常狀態(tài)下上皮細胞通過細胞間黏附機制緊密連接在一起，E鈣黏蛋白(Ec

12、adherin)是組成上皮細胞間緊密連接的重要成分，在保持細胞完整性和極性中起重要作用。TGF1誘導的EMT早期變化就是E鈣黏蛋白表達受到抑制，也就是細胞間緊密連接的破壞上皮細胞喪失黏附特性，逐漸從基底膜上脫落然后胞質內細胞骨架進行重排表達新的表型蛋白如平滑肌肌動蛋白(SMA)胞質內肌絲也從上皮型的角蛋白(cytokeratin)轉變?yōu)殚g質細胞的波形蛋白(vimentin)[5]。細胞形態(tài)由鵝卵石狀變成梭形，類似成纖維細胞或者肌纖維母細

13、胞，電鏡下可見細胞極性發(fā)生改變，微絨毛消失，細胞內出現(xiàn)密體，胞質內出現(xiàn)大量肌動蛋白微絲。如果細胞在過渡階段，兩類細胞標志可同時表達。這些變化可能為細胞遷徙、收縮能力增強提供了形態(tài)學基礎。本研究中，A549細胞在5ngmlTGF1的誘導下，上皮細胞標志物Ecad的mRNA表達在24h內總體呈現(xiàn)下調趨勢，在第24小時時間點上最明顯間接免疫熒光也顯示Ecad蛋白隨時間延長表達減少這說明TGF1可以直接誘導肺EMT的發(fā)生，而且這種作用還存在時間

14、依賴性。Ecad在第3小時時間點上出現(xiàn)一個短暫反彈推測可能與TGF1促進A549細胞自分泌TGF1到達一定水平產生的負反饋作用有關。在很多器官包括肺的纖維化的誘導中，TGF1作為總開關被連接在一起[6]。單是TGF1在幼鼠和成年鼠肺中的定向表達就可以在微乎其微的炎癥下誘導出顯著的纖維變性反應[7]，而且如前所討論，TGF1激活障礙可以提供明顯的保護作用，阻止博萊霉素在轉基因小鼠中誘導的纖維化[8]。這一切似乎提示了，正是因為TGF1在E

15、MT的誘導中起到主導作用，它具有極強的促進上皮細胞表型喪失的能力，因此在肺纖維化的發(fā)生中起了關鍵作用。目前，大量涉及EMT的研究主要集中在癌轉移及腎纖維化上。EMT在腎纖維化形成中起到突出的作用，在這一過程中，上皮細胞失去了細胞細胞附件、極性和上皮細胞的特異性標記，經(jīng)歷了細胞支架的重塑，而獲得間質細胞的表型。本研究用TGF1誘導A549細胞發(fā)生了EMT，說明肺泡上皮細胞在體外確實可以發(fā)生EMT。但究竟是Ⅰ型肺泡上皮細胞(AT1)還是Ⅱ型

16、肺泡上皮細胞(AT2)，或者AT1和AT2兩種肺泡上皮細胞都經(jīng)歷了EMT仍不確定?？赡芴囟ǔ潭鹊膿p傷使AT1細胞更有可能經(jīng)歷凋亡而AT2細胞優(yōu)先選擇了EMT。在體外實驗中，AT2細胞逐漸表達并獲得的所有AT1的表型標志，這表明了AT2細胞在體外朝AT1細胞表型(類AT1細胞)轉分化[910]。目前的實驗條件可以做到將已經(jīng)獲得AT1細胞特征的細胞再次誘導恢復到AT2細胞表型[10]，說明了分化的AEC表型表現(xiàn)出來的可塑性遠比之前想象的要大