單子葉石蒜科植物黃花石蒜甘露糖結(jié)合凝集素基因的克隆及序列分析風(fēng)雨花凝集素基因轉(zhuǎn)化煙草及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)

1、第一部分單子葉石蒜科植物黃花石蒜甘露糖結(jié)合凝集素基因的克隆及序列分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)研究生：常麗青指導(dǎo)教師：鮑錦庫摘要：黃花石蒜凝集素(卻∞mchinensisAgglutinin，LCA)是來源于石蒜科的具有多重生物學(xué)活性的甘露糖結(jié)合蛋白，屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集索。這類凝集素由于具有獨(dú)特的糖結(jié)合特異性、逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制活性和保護(hù)農(nóng)作物免受昆蟲和線蟲攻擊而引起人們濃厚的興趣。本文采用同源克隆的方法，通過對(duì)黃花石蒜球莖RNA的提取

2、，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，從Genbank上比較已登錄的石蒜科凝集素的序列，找出其保守序列，并結(jié)合軟件設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行3’RACE末端快速擴(kuò)增，得到了3’端的部分序列(序列號(hào)為AY690318)，序列長(zhǎng)為516bp，然后根據(jù)已得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用在eDNA的37端隨機(jī)添加若干PolvA的方法，在eDNA模板3’端加上PolyA，再以此為模板進(jìn)行PCR，從而克隆得到了黃花石蒜5’端的部分序列(序列號(hào)為AY763111)，序列長(zhǎng)為4

3、1lbp，將37與5’序列合并，就能獲得cDNA全長(zhǎng)序列(序列號(hào)為AY763112)。以獲得的全長(zhǎng)cDNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列與石蒜科其他植物凝集素在Genbank中的Blast上進(jìn)行比較，可知黃花石蒜的全長(zhǎng)cDNA序列由683個(gè)核苷酸組成，開放閱讀框長(zhǎng)486bp，編碼162個(gè)氨基酸，起始密碼子位于第3739bp，終止密碼子位于在523—525bp處，在起始密碼子上游有一個(gè)由36個(gè)堿基組成的5’非編碼區(qū)；在終止密碼予下游有一個(gè)由14

4、1個(gè)堿基組成的3’非編碼區(qū)，包括兩個(gè)加poly(A)信號(hào)和一段真核生物rnRNA所特有的polkA)序列。通過序列的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)LCA基因均編碼前體蛋自：含有信號(hào)肽序列、成熟蛋白序列和C一末端剪切序列。該成熟蛋白由109個(gè)氨基酸組成，分子量為121KD。MolecularCloningandAnalyzingofAgglutininfromLycorischinensisMajor：Biochemistryandmolecularbiol

5、ogyGraduate：ChangLi—QingTutor：BaoJinKuAbstract：LycorischinensisAgglutinin(LCA)fromAmaryllidaceaespeciesisamannose—bindingproteinwithvariousbiologicalactivitiesItbelongstothemonocotmaimose—bindinglectin(MBL)Thelectinshave

6、receivedalotofattentionindifferentscientificdisci[Ilinesbecauseoftheiruniqueandexclusivespecificitytowardsmannose，theirretrovirusinhibitoryactivityandtoxicitytoinsectsThetotalRNAofLy’corischinensiswasextractedandthenreve

7、rsetranscriptintoeDNAAprimerWaSdesignedbasedontheconservedlegionsofother～BLplant’SaggIntininthroti曲homologyalignmentUsingtheRTPCR，3’RACE(rapidamplificationofeDNAends)technique，aDNAfragmentswasfirstclonedfromLycorischinen

8、sisbyperformingPCRthatusedLycorischinensiseDNAgenomeasthetemplateIthas516nucleotides(accessionnumberinGenbank：AY690318)Thenanothertwoprimersweredesignedaccordingt0thesequenceof3’endsODewasusedteversetranscripttheRNAintoe

9、DNA，polyAwereaddedtothe3’endsofeDNAwiththefunctionofTdT(TerminalDeoxynucleotidylTransferase)，usingthe5’RACEtechniquethefragmentof411nucleotideswascloned(accessionnumberinGenBank：AY763111)ThetwopartiallyoverlappingeDNAfra

10、gmentswereassembledafull—lengtheDNAsequenceofLycorischinensis(accessionnumberinGenbank：AY763112)Thefull—lengthcDNAhad683bp，andthesequenceencodedanopenreadingframeof162aminoacidsThestartcodonwasat3739b口andthestopcodonwas3