rhizobiumsp.th菌降解微囊藻毒素的機理及mlra基因的進化來源

1、 分類號 密 級 UDC 學校代碼 10497 學 位 論 文 題目 Rhizobium sp.TH 菌降解微囊藻毒素的機理及 mlrA 基因的進化來源 英文 Biodegradation mechanism of microcystin-LR by Rhizobium sp. 題目 TH and the evo

2、lutionary origin of the mlrA gene 研究生姓名 祝 曉 蕓 姓名 陳曉國 職稱 教授 學位 博 士 單位名稱 資源與環(huán)境工程學院 郵編 430070 申請學位級別 工學碩士 學科專業(yè)名稱 環(huán)境科學與工程 論文提交日期 2016 年 4 月

3、 論文答辯日期 2016 年 5 月 學位授予單位 武漢理工大學 學位授予日期 2016 年 6 月 答辯委員會主席 張高科 評 閱 人 肖邦定 黃 敏 2016 年 05 月 指導教師 I 中文摘要 微生物降解是微囊藻毒素（MCs）在環(huán)境中歸趨的主要途徑，研究 MCs 的微生物降解過程和機理對認識 MCs 在環(huán)境中的歸趨具有重要意義。目前已從環(huán)境中分離

4、出 60 余株 MCs 降解菌，它們主要集中于 α-變形菌綱的鞘氨醇單胞菌目，且多具有 mlrA 基因，說明這些菌可能通過 mlr 途徑降解 MCs。由于缺少mlr 基因序列信息，尤其是來自非鞘氨醇單胞菌目的 α-變形菌的 mlr 基因信息，使得對 mlr 基因的進化來源及其在降解菌中的分布仍缺乏認識。 此前， 本實驗室從太湖沉積物中分離出一株 MCs 降解菌 Rhizobium sp. TH， 該菌是首株屬于非鞘氨醇單胞菌目的 α-變

5、形菌綱的 MCs 降解菌。 盡管在 TH 菌中未能檢測到 mlrA 基因，但是檢測到了 mlrB、mlrC 和 mlrD 基因，說明該菌可能通過 mlr 途徑降解MCs。該降解菌的分離為研究 mlrA 基因的進化來源及分布提供了理想材料。 本研究首先利用新設計的引物對 TH 菌的 mlrA 基因進行 PCR 擴增檢測， 然后通過普通 PCR 和步移 PCR 擴增 mlr 基因簇基因間序列及其兩端未知序列， 測序拼接獲得 TH 菌的 ml

6、r 基因簇全序列，并在此基礎上對 mlr 基因簇中的基因進行了序列分析及異源表達驗證，確認了 TH 降解 MCs 的機理。通過對已有 MCs降解菌 mlrA 基因及 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹的比較， 對 mlrA 基因的進化來源及其在降解菌中的分布進行研究。具體的研究內(nèi)容及結果如下： （1）根據(jù)已報道的 mlrA 基因序列設計引物 mlrAtf/mlrAtr，利用該引物成功檢測到 TH 菌 mlrA 基因。比對結果表明，引物 mlr

7、Atf/mlrAtr 與來自不同屬 MCs降解菌的 mlrA 基因均高度匹配，說明該引物具有廣泛的適用性，可用于對環(huán)境中的 mlrA 基因進行檢測，以便對 MCs 污染進行環(huán)境風險評估。 （2）通過普通 PCR 對 TH 菌 mlr 基因簇基因間序列進行擴增，測序后拼接得到 mlr 基因簇部分序列，然后利用步移 PCR 對 mlr 基因簇兩端未知序列進行擴增測序，最終獲得全長為 6673 bp 的 TH 菌 mlr 基因簇全序列。該基因

8、簇中依次含有 mlrC、mlrA、mlrD 和 mlrB 4 個基因，其中 mlrA 和 mlrD 基因與 mlrB 和mlrC 基因的轉錄方向相反。 （3） 通過對降解基因及其蛋白的功能和結構的預測可知， TH 菌 MlrA 酶含有 H260AIH263NE265 基序，推測該基序可能為該酶的活性中心。MlrA 和 MlrD 酶均含有跨膜區(qū)，且 MlrA 酶還具有信號肽序列，而 MlrB 和 MlrC 酶均不含信號肽和跨膜區(qū)。MlrB