l-精氨酸對hela細(xì)胞增殖的調(diào)控作用研究

1、· 1 00 ·[ 文章 編 號 ] 1 0 0 5 — 1 1 3 9 ( 2 0 0 4 ) 0 2 - 0 1 0 0 - 0 3軍 醫(yī) 進(jìn) 修 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 2 0 0 4A p r ， 2 5 ( 2 ) A c a dJP L AP o s t g r a dMe dS c h? ‘ ’L - 精 氨酸 對 He l a細(xì)胞 增 殖 的調(diào) 控 作 用研 究 董 矜 ，田亞平 ， 房征 宇( 解 放軍

2、 總 醫(yī) 院 生 化 科 ， 北 京 1 0 0 8 5 3 )[ 摘 要 ]目的 ： 研 究 L 一 精氨 酸 ( L - a r g ) 作 為 一氧 化氮 ( N O ) 合 成 底 物 ， 在 不 同 濃 度情 況 下 對 人 宮 頸 癌 細(xì) 胞 ( H．1 a )增 殖 的調(diào)控 作 用 。 方 法 ： 四 甲基偶 氮 唑 ( M r 幾 )法 檢測 H e l a 細(xì) 胞 的增殖 活 性 ； 同時(shí)檢 測 細(xì)胞 培養(yǎng) 液 中亞

3、硝酸 鹽 濃度 觀察 一 氧化 氮合 成 的變 化 。結(jié)果 ： 1 ～ 3 0m m o l ／ L 的 L - a r g 抑 制 H e l a 細(xì) 胞 生 長活性 ； 當(dāng)培 養(yǎng) 液 中 L - a r g濃 度 達(dá) 5 0 ～1 0 0m m o l ／ L時(shí)可 改 變細(xì) 胞 生長 狀態(tài) ， 呈懸 浮狀 ， 但細(xì) 胞 活性 提 高 ； 培 養(yǎng) 液 中 的亞 硝 酸鹽 ( N O’ ) 濃度 伴 隨 L - a r g濃 度 的增

4、加 而升 高 。 結(jié) 論 ： L - 精 氨 酸對 腫瘤 細(xì) 胞 的生長 繁殖 具 有 雙重調(diào) 節(jié) 功效 。[ 關(guān) 鍵詞 ] 精 氨 酸 ； 一 氧 化氮 ； 增 殖 ； 腫 瘤[ 中圖分 類 號 ] Q 5 9 9[ 文 獻(xiàn)標(biāo) 識碼 ] AEfe c to fd i fe r e n tc o n c e n t r a t i o n so fL- Ar g i n i n eo npr o l i f e r a t i o no

5、 fH e l aD O NGJ i n ，T I A N Y a - p i n g， F A N GZ h e n g — y u ( C l i n i c a lB i o c h e mi s t r yD e p a r t me n t ， PG e n e r a lHo s p i t a l ， B e i j i n g1 0 0 8 5 3。Ch i n a)[ A b s t r a c t ]o b j e

6、 c t i v e ： T oi n v e s t i g a t et h ep r o l i f e r a t i o no fh u m a nc e r v i c a lc a r c i n o m ac e l ll i n e ( H e l a )a f f e c t e db yt h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fL — a r g i n

7、 i n et h a ta c t sa st h ed o n o ro fn i t r i co x i d e ．M e t h o d s ： Th eMT Ta s s a yh a db e e nu s e dt od e t e c tt h ep r o l i f e r a —t i o no fHe l ac e l l sa n dGf i e s sa s s a yt ome a s u r et h

8、ec e l l u l a rme t a b o l i t e so fn i t r i co x i d ed e r i v a t i v e s ． Re s u l t s：L- a r g i n i n ei n c r e a s dNO2 。 c o n c e r t r a t i o ni nc u l t u r eme d i u m ，1～3 0 mmo l ／ LL — a r g i n i n

9、 ei n h i b i t e dt h ea c t i v i t yo fHe l ac e l l s ，u n d e r5 0 —1 0 0t h emmo l ／ Le n h a n c et h ea c t i v i t yo ft h ec e l l s ，b u tt h eg r o wt hs t y l ewa sc h a n g e df r o m a d h e r et ot h ewa

10、 l lt ot h ef lo u t i n g ．Co n c l u s i o n： t h eL — a r g i —n i n ep o s s e s s e st h eb i — d i r e c te f f e c to nt u mo rc e l lp r o l i f o r a t i o n ．[ Ke yw o r d s ]L — a r g i n i n e ； n i t r i co

11、x i d e ； p r o l i f e r a t i o n ； t u m o rL 一 精氨酸是 一 氧化 氮合 酶 的底 物 ， 用 以生 成 一 氧化 氮 ( N O ) ， 所 產(chǎn) 生 的 N O 作 為 自 由基 氣 體 小 分 子 具 有 兩 種 不 同 的 生 物 學(xué) 效 能 ： 它 一 方 面 通 過 激 活 可 溶性 鳥 苷 酸 環(huán) 化 酶 合 成 c G MP發(fā) 揮 其 生 理 調(diào) 節(jié) 作 用 ； 同

12、時(shí) 它 又 具 有 細(xì) 胞 毒 作 用 ’。許 多 研 究 認(rèn) 為一氧化氮可通 過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)抑 制腫瘤的 生長繁 殖 。 筆 者 通 過 觀 察 N O 合 成 的 底 物 L 一 精 氨 酸 對 人 宮 頸 癌 細(xì) 胞 ( H e l a ) 增 殖 的 影 響 ， 探 討 L ． a r g ／ N O合 成 對 腫 瘤 細(xì) 胞 生 長 的 影 響 。1 材 料 和 方 法 1 ． 1 材 料 人 宮 頸 癌 細(xì) 胞 株 ( H

13、e l a ) 購 于 上 海 細(xì) 胞 生物學(xué) 研究所 ； L 一 精氨酸 、 四甲基偶 氮唑 ( MT T ) 購于 S i g m a 公 司 ； 亞 硝 酸鹽 檢 測試 劑 盒 由解 放 軍 總 醫(yī) 院 [ 收 稿 日期 ] 2 0 0 3 - 0 9 - 2 2[ 修 回 日期 ] 2 0 0 31 0 - 2 8[ 基 金項(xiàng) 目] 國家 自然科學(xué) 基金 資助 項(xiàng) 目( 3 0 2 7 0 3 5 0 )[ 作者 簡 介 ] 董

14、 矜 ( 1 9 7 9) ， 女 ， 北京 人 ． 軍醫(yī)進(jìn) 修 學(xué)院 0 l級 碩士 研 究 生 ， 導(dǎo)師 田亞 平教 授 電話 ： ( 0 1 0) 6 6 9 3 6 2 1 4提 供 ； 酶 標(biāo) 儀 為 美 國 B i o — R a dM o d e l3 5 5 0一 u V 酶 標(biāo) 儀 ( B i o — R a dM o d e l3 5 5 0一 u VM i c r o p l a t eR e a d e r )

15、。1 ． 2 方 法 1 ． 2 ． 1H e l a 細(xì) 胞 的培 養(yǎng) H e l a細(xì)胞 培 養(yǎng) 于 含 1 0 ％胎牛血清 R MP I1 6 4 0 ( 美 國 G I B I C O) 培養(yǎng)液 中， 置于 3 7℃ 5 ％ C O孵箱 中培 養(yǎng) ， 每 2d換 1次液 ， 每周傳 代 1次 。1 ． 2 ． 2 不 同 濃 度 的 L 一 精 氨 酸 對 H e l a 細(xì) 胞 的增 殖 作 用 取 對 數(shù) 分 裂 期 的 H

16、 e l a 細(xì) 胞 ， 用 0 ． 1 2 5 ％ 的胰 蛋 白酶消化 處理進(jìn) 行細(xì)胞 計(jì)數(shù) 、 加 入 9 6孑 L 板 ， 調(diào) 節(jié)細(xì) 胞 數(shù) 每孑 L 為 3X1 0。分 別加 入 不 同濃度 的 L 一 精 氨 酸 1 0l ， 總體 系 為 每 孔 1 0 0l ， L 一 精 氨 酸 終 濃 度 為 1 0 0， 7 0， 5 0， 3 0， 1 0， 7， 5， 1 ， 0 ． 5 ， 0 ． 1mm o l ／ L。將

17、9 6孑 L 板 放 置 于 3 7℃ 5 ％ C O ， 孵 箱 中培 養(yǎng) 4 8h后 取 出照相 ， 每孑 L 加入 1 5lM T T ， 振蕩 1 5m i n 、 3 7℃ 放置 4h后 ， 加入 1 0 ％ S D S ， 振 蕩 2 0m i n ， 3 7℃ 過 夜 ， 在 酶標(biāo)儀上檢測 波長 5 7 0n m、 參考 波 長 6 3 0l l m 處 測 量 OD 值 。1 ． 2 ． 3H e l a細(xì)胞 代謝產(chǎn) 物

18、亞硝 酸鹽 的測定 采用 維普資訊 http://www.cqvip.com · l 02 ·升高 。有關(guān)報(bào)道 指 出腫瘤 細(xì)胞 線 粒體 功 能障 礙 ， 因 此 導(dǎo)致 A T P生 成 不 足 ， 糖 酵 解 增 加 。本 研 究 中高 濃 度 L — a r g所致 的 M T T結(jié)果 升高 ， 可 能與促 進(jìn) 和恢 復(fù) 腫瘤細(xì)胞線粒體 功能有關(guān) 。L · a r g是一種 非必需氨基酸 ， 在代謝

19、過程 中可生 成 N O， 多胺 及 L一脯 氨 酸 等 ， 參 與 細(xì) 胞 生 長 的 調(diào) 節(jié) 。作 為一氧化 氮 的供體 ， L ． 精氨酸濃 度 的增加 可激活 i N O S合成 大量 N O 及其代 謝產(chǎn) 物 。腫 瘤 轉(zhuǎn)移 的過程是 多因 素共 同作用 的結(jié)果 ， 轉(zhuǎn) 移 的初 步 過 程 即瘤 細(xì)胞 脫 離 原 發(fā) 腫 瘤 組 織 ， 隨淋 巴管 、 血 管 或 直接遷移至 身體其他 部位 形成 新 的腫 瘤轉(zhuǎn) 移灶 ，

20、 細(xì) 胞 間 粘 附 分 子 ( I C A M． 1 ) 、 血 管 細(xì) 胞 粘 附 分 子 ( V C A M 一 1 ) 與惡性腫 瘤的復(fù)發(fā) 、 轉(zhuǎn) 移密切相 關(guān) “，惡性腫瘤經(jīng)手術(shù) 等有效治療后粘 附分子水平均不 同 程度降低 ¨。同時(shí) 有研 究 發(fā) 現(xiàn) N O 可 抑制 細(xì) 胞粘 附 分 子 的 表 達(dá) 從 而 阻 止 細(xì) 胞 粘 附 ， 筆 者 亦 發(fā) 現(xiàn) L ． a r g高 濃 度 組 可 改 變 瘤 細(xì) 胞

21、形 態(tài) ， 使 瘤 細(xì)胞 游 離 且 出現(xiàn) N O及 其衍 生 物 的積 累 ， 說 明高 濃 度 的 L — a r g可使培養(yǎng)細(xì)胞失 去貼壁生長特性可 能與 N O抑制粘 附分子有關(guān) 。另外 ， 一定 濃 度 的 L — a r g可 通 過增 加 N O 的合成 發(fā)揮 細(xì)胞 毒 性 作 用誘 導(dǎo)凋 亡 、 抑 制 腫瘤 細(xì)胞增 殖¨， 據(jù)此 目前臨床研究 在癌 癥患者膳 食 中補(bǔ)充 L — a r g可 抑 制 腫 瘤

22、生 長 、 強(qiáng) 化 患 者 的 免 疫 功 能 。本 研 究 結(jié) 果 從 理 論 上 進(jìn) 一 步 證 明 了 L - a具有 防治 腫 瘤 的功 效 ， 值 得 注 意 的是 不 同劑 量 的 L ． a r g具有不 同的防治機(jī)制 ?？傊?， 本研究 結(jié) 果 進(jìn)一 步 證 明 了 L — a r g具 有 防 治腫 瘤 細(xì) 胞 生 長 繁 殖 的功 效 ， 其 反 應(yīng) 機(jī) 制 可 能與 L ． a r g在細(xì)胞 中代 謝 生成 的

23、N O 介導(dǎo) 的生 長抑 制 和 恢 復(fù)腫瘤細(xì)胞線 粒體 代謝有關(guān) 。[ 參 考文 獻(xiàn) ][1 ]M o n c a d aS ， P a l m e rR M J ，H i g g sE A ．N i t r i co x i d e： p h y s i o l o g y3[ 4[5 ：[6 ][7 ]【8 ][ 9 ][ 1 0 ][ 1 2 ][ 1 3 ][ 1 4 ]p a t h o p h y s i o l o g

24、y ， a n dp h a r m a c o l o g y[ J ] ．P h a r m a c o lR e v ， 1 9 9 1 ，4 3 ： 1 0 9 · 1 4 2 ．[ 1 5 ][2 ]M o n c a d aS ， H i g g sE A， H o d s o nH F ， K n o w l e sR G ， e ta 1 ． T h eL ·A r g l n i n e ： n i

25、 t r i co x i d ep a t hw a y [ J ] ． JC a r d l o v a s c u l a r - P h a r m a c o l ，1 9 9 1 ， 1 7 ( S 3 ) ：S 1 - $ 9 ．軍 醫(yī) 進(jìn) 修 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 2 O O 4A p f ， 2 5( 2) A c a dJP L AP o s t g r a dMe dS c h’P’Be c k ma nJ S． Be

26、c k ma nTW ．Ch e nJ ． e ta 1 ． Ap p a r e n th y d r o x y lr a d i c a lp r o d uc t i o nb yp e r o x y n i t r i t e： i mp l i ca t i o n sf o re n do t h e l i a li n j u r yf r o mn i t r i co x i d ea n ds u p e r

27、o x i d e [ J ] ． P r o cN a t lA c a dS c iUS A ，1 9 9 0， 8 7：1 6 2 0- 1 6 2 4．S t u e h rDJ，Na t ha nCF． Ni t r i co x i d e ．a(chǎn)ma c r o p h a g ep r o d u c tr e ．s p o ns i b l ef o rc y t o s t a s i sa n dr e s p i

28、r a t o r yi n h i bi t i o ni nt umo rt a r g e tc e l l s[ J ] ． JE x pM e d ， 1 9 8 9 ， 1 6 9 ( 5 ) ： 1 5 5 4 ． 1 5 5 5 ．Mo s ma nnT J ． Ra p i dc o l o r i me t r i ca s s a yf o rc e l l u l a rg r o wt ha n ds ur ．

29、r i v a l ： a p p l i c a t i o nt op r o l i f e r a t i o na n dc y t o t o x i c i ya s s a y s [ J ] ． JI m-mu n o lMe t h，1 9 8 3， 6 5 ( 1 ． 2) ： 5 5 - 6 3 ．Ge r l i e rD ．Th o ma s s e tN． Us eo fMTT c o l o r i m

30、e t r i ca s s a yt ome a s -u r ec e l la c t i v a t i o n[ J ] ． J I m m u n o l Me t h o d s ， 1 9 8 6 ， 9 4 ( 1 ． 2 ) ： 5 7 ．6 3．Ke t t l e rM ，I k e g a g y aN ， Br e e sDK ，e ta 1 ．L- a r g i n i n eme t a b o l i

31、 s m i ni m m u n em e d i a t e dg l o m e r u l o n e p h r i f si nt h er a t [ J ] ． A mJK i d n e yD i s ，1 9 9 6， 2 8 ( 6) ：8 7 8 · 8 8 7 ．W a d d i ng t o nSN，Mo s l e yK ，Co o kHT ，e ta 1 ． Ar g i n a s eAt

32、i su p -r e g u l a t e di na c u t ei m m u n ec o m p l e xi n d u c e di n f l a m m a t i o n [ J ] ．B i o c h e m B i o p h y sR e sC o mmu n ，1 9 9 8， 9 2 4 7( 1 )： 8 4 - 8 7 ．J o h a n s s o nR K， P o l j a k o v

33、 i cM ，A n d e r s s o nK E， e ta 1 ．E x p r e s s i o no fn i t r i co x i d es y n t ha s ei nbl a d d e rs mo o t hm u s c l ec e l l s：r e g u l a t i o nb yc y t o k i n e sa n dL - a r g i n i n e [ J ] ．JU r o l ，

34、2 0 0 2 ， 1 6 8 ( 5 ) ： 2 2 8 5 -22 8 7．Ru e oL P，St o p pa c e i a r oA ，Ue e i n iS， e ta 1 ．Ex pr e s s i o no fi n t e r c e l —l u l a ra d he s i o nmo l e c u 1 ． 1a n dv a s c u l a rc e l la d he s i o nmo l e c

35、 u l ei nu n i di f e r e n t i a t e dn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o maa n di nma l i g na n te p i —t h e l i a lt u m o r[ J ] ． H u mP a t h o l ， 1 9 9 4 ， 2 5 ： 9 2 4 - 9 2 8 ．B u s s o nP，Z h a n gQ，G u

36、i l l o nJ M ， e ta 1 ．E l e v a t e de x p r e s s i o no fI CAM · 1a n dCD58i nEp s t e i nVi r u spo s i t i v en a s o p h a r y g e a lc a r c i —n o m ac e l l s【 J ] ．I n tJC a n c e r ， 1 9 9 2 ， 5 0 ： 8 6 3

37、 - 8 6 7 ．王連聰 ， 柬美 寶 ， 魏 啟春 ， 等 ． 鼻 咽癌 細(xì) 胞 間 牯 附分 子 · 1 升 高 的 臨床意 義 [ J ] ．中 華 耳 鼻 咽 喉 科 雜 志 ， 2 0 0 0 ，3 5 ( 6 ) ： 4 6 9471 ．L i nHC ，W a n gCH ，YuCT，e ta 1 ． En d o g e n o u sn i t r i co x i d ei n—h i bi t sn e

38、 u t r op h i la dh e r e n c et ol un ge p i t h el i a lc e l l st omo du l a t ei n ·t e r l e u k i n - 8r e l e a s e[ J ] ．L i f eS c i ， 2 0 0 1 ， 6 9 ( 1 1 ) ： 1 3 3 3 ． 1 3 4 4 ．L o u i sJ ，l g n a r rO，G e

39、 o r g e t t eM ， e ta 1 ．Ro l eo ft h ea r g i n i n e · n i t r i co x i depa t hwa yi nt h er e g u l a t i o no fv a s c u l a rs mo o t hmu s c l ec e l lp r o l i f e r a t i o n[ J ] ．P r o cN a t lA c a dS c

40、 iU S A， 2 0 0 1 ， 9 8 ( 7 ) ： 4 2 0 2 -42 0 8S o n gJ X，Q i n gS H，Hu a n gXC，e ta 1 ．E f f e c to f p a r e n t e r a ln u t r i ·t i o nwi t hL - a r g i n i n es “ p p l e me n t a t j o no np o s t o p e r a t

41、i v ei mmu n ef u n c t i o ni np a t i e n t sw i t hc o l o r e c t a lc a n c e r[ J ] ．Y iJ u nY iD aX u eXu eB a o ， 2 0 0 2， 2 2( 6) ： 5 4 5 · 5 4 7 ．( 上 接 8 3頁 )病 例選 擇 。原 則上 胸 降主 動脈 瘤 可考 慮應(yīng) 用 。應(yīng) 除 外 ： ① 感 染 性

42、 、 先 天膠 原性 降主 動脈瘤 、 Ⅲ期梅 毒 所 致 大血 管 疾 病 ； ② 瘤 體 累及 重要 臟器 供血 的 血 管 ； ③ 導(dǎo) 絲不 能通 過 瘤 體 ， 輸 送 徑 路 血管 嚴(yán)重 迂 曲 。合 適 的 支 架 選 擇 是 成 功 的 關(guān) 鍵 。 支架 直 徑較 實(shí) 際血 管 內(nèi)徑 大 l 5 ％ 一 2 0 ％ ； 較 瘤 體 長 2～ 4c m 。 支 架 的精 確定 位 也 是 腔 內(nèi) 治 療 成 功 的 重 要