pegfp／hvegf121融合蛋白真核表達載體的構(gòu)建及在骨髓間質(zhì)干細胞中的表達

1、中國病理生理雜志 C h i n e s eJ o u r n a lo fP a t h o p h y s i o l o g y2 0 0 5 ， 2 1 ( 9 ) ． 1 6 8 1 二 魚[ 文章編號 ]1 0 0 0 — 4 7 1 8 ( 2 0 0 5 ) 0 9 —1 6 8 1 — 0 5·l 6 8 1·p E G F P ／ h V E G F 1 2 1融合 蛋 白真 核 表 達 載 體

2、的 構(gòu) 建 及 在 骨 髓 間質(zhì) 干 細胞 中 的表 達 蘇 立 ，陳運 貞，張 曉剛 ，張 潤峰 ( 重慶醫(yī)科 大學 附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科 ， 重慶 4 0 0 0 1 6 )[ 摘 要]目的： 構(gòu)建攜 帶人血管內(nèi)皮細胞 生長因子 1 2 1 及綠 色熒光蛋 白報告 基 因的融合蛋 白真核 表達質(zhì)粒 并檢測其在骨髓 問質(zhì) F 細胞 ( M S C ) 中的表達 。方法 ：采用 P C R技術(shù) ， 以 p C D ／ h V E G F

3、1 2 1 質(zhì)粒 為模板 擴增 V E G F 1 2 1 基 因拿長 ， 采用 P C R產(chǎn)物 的粘端 兜隆法 ， 將 V E G F 1 2 1 定向克隆 入 p E G F P—C I的多克隆位點 ， 構(gòu)建 p E G F P ／ h V E G F 1 2 1重 組 質(zhì)粒 ， 酶切 、 P C R及序列分析鑒定 ， 脂質(zhì)體介 導轉(zhuǎn)染體 外培養(yǎng) 的 M S C ， 熒光 顯微鏡及 免疫細胞 化學染 色檢測 E G F P ／V E

4、 G F 融合蛋 白的表達 。結(jié) 果 ：P C R、 酶切 及 測 序證 實 目的基 因 V E G F 1 2 1正確 連 接至 p E G F P—C 1的 多 克隆 位點 ，p E G F P ／ h V E G F 1 2 1 重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 M S C 后 ， 熒光顯微鏡 及免疫 細胞化學 檢測 E G F P ／ V E G F 蛋 白在 M S C中存在 表達 。 結(jié) 論 ： 成功構(gòu)建 了攜帶 人 V E G F 1 2

5、1 及 E ( , F P報告 基因的融 合蛋白真核表達 質(zhì)粒 ， 并在 M S C中獲得表達 ， 為進一步 研究 V E G F 基 因治療 缺血性 心血管疾 病及 M S C的分化奠定 了實驗基礎(chǔ) 。[ 關(guān)鍵詞 ]內(nèi)皮生 長因子 ； 綠 色熒光蛋 白； 融合蛋 白質(zhì)類 ； 基 因表達 ； 骨髓 ； 問質(zhì)干細胞 [ 中圖分類號 ] R 3 6 3[ 文獻標識碼 ] ACo n s t r u c t i 0 n0 fe u k a r

6、 y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rwi t hEGF Pa n dh VEGF1 2 1f u ．s i o np r o t e i na n di t se x p r e s s i o n i nm e s e n c h y m a ls t e m c e l l so fr a t s S UL i ，C H E NY u n—z h e n，Z HAN GX i a o

7、—g a n g ，Z HA NGRu n—f e n g( D e t m r t m e n to fC a r d i o l o g ) ，T h eF i r s tA f f il i o ~ dH o s p i t a l ，C h o n g q i n gU n i v e r s i t yo fMe d i c a lS c i e n c e s ，C h o n g q i n g4 0 0 0 1 6 ，C

8、 h i n a )[ A B S T R A C T]A I M；T oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n tp l a sm i dc a r r y i n ge n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i na ndh u m a nv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t

9、hf a c t o r121g e n ea ndt ( )d e t e c ti t se x p r e s s i o ni nr a t sme s e n c h y ma ls t e m c e n s( MS C s ) ．ME 3I - I OI ~ ：H u ma nV E G F 1 2 1c D N Aw a sa m p l i f i e dw i t hp o l y m e r a s ec h a

10、 i nr e a c t i o n( P C R )f r o mp C D ／ h V E G F 1 2 1a ndw a si n s e r t e di n t ot h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp E GF P—C1 ． T h er e c o mb i n a n tp l a s mi dp E G F P ／ h V E GF 1 2 1

11、W a s i d e n t i f i e d w i t hP C R，d o u b l ee n z y med i g e s t i o na n dD NAs e q u e n c i n g ．T h e nt h i sr e c o mb i n a n tp l a sm i dw a st r a n s f e e t e di n t or a t ’ SMS C sw i t h l i p o

12、f e c t a mi n e ．T h ee x p r e s s i o no fE G F Pa n dVE GF 12 1p r o t e i nw e r ed e t e c t e d w i t hf l u o r e s c e n c emi c r o s c o p ea n di mmu n o c y t o c h e mi c a ls t a i n i n g ．r e s p e c t

13、 i v e l y ．RES ULT S：T h er e —c o mb i n a n tp l a smi dW a s c o n f i r m e d w i t hP C R，d o u b l ee n z y med i g e s t i o na n dD NAs e q u e n c i n g ．T h ef l u o r e s c e n c emi c r o s c o p ea n di

14、m—mu n o c y t o c h e mi e a ls t a i n i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt heE G F Pa n dV EG F 1 2 1p r o t e i nw e r ee x p r e s s e di nMS C s4 8 ha f t e rt r a n s f e c t i o n ．CONCL US I ONS：T h er e c o m

15、b i n a n tp l a smi dc a r r y i n ge n h a nc e d g re e nf l u o r e s c e n tp r o t e i na ndh u ma nv a s c u la re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c —t o rW a s s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n

16、de x p r e s s edp o s i t i v e l yi nr a tMS C s ．I tp r o v i d e sag o o db a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nd i f e r e n t i a t i o no fMS Ca n dVE GFg e n et h e r a p yf ori s e h e mi a lc a r d i o v

17、 a s c u l a rd i s ea s e．[ K E YWOR D S ]E n d o t h e l i a lg ro w t hf a c t o m；G r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ；F u s i o np r o t e i n s ；G e n ee x p r e s i o n ；B o n em a r r o w ；Me s e n c h y

18、ma ls t e m ( ： e l l s血 管 內(nèi) 皮 細 胞 生 長 因 子 ( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ， V E G F ) 是一種高度特異 的血管 內(nèi)皮細 胞有絲分裂原 ， 促進 m管 內(nèi)皮細胞增殖 ， 對缺血組織 血管新生 、 側(cè)枝循環(huán)形成具有重要作用。V a n等 1j研究 表 明 V E G F能 加 速人 工 血 管 或

19、 血 管 支架 植 入 后 內(nèi)皮化 ， 減少血栓形成 ， 并具有防止介入治療后管腔 再狹 窄 的作 用 。骨 髓 間質(zhì) 干 細 胞 ( m e s e n c h y m a ls t e m[ 收稿 日期 ] 2 0 0 3 — 1 2 — 0 2[ 修 回 日 期 ] 2 0 0 4 — 0 3 —1 6c e l l s ， MS C ) 是 骨髓 中 除造 血 干 細 胞 以 外 的另 一 類 干 細胞 ， 因其具有多向分化潛能

20、且來源豐富易于獲取 ，有望成 為 較 為 理 想 的 工 程 種 子 細 胞 。 本 實 驗 以 p C D ／ h V E G F 1 2 1 和 p E G F P —C 1 質(zhì)粒為基礎(chǔ) ， 構(gòu)建攜帶 人 V E G F 1 2 1 和增強綠色熒光蛋 白( e n h a nc e dg r e e nf l u —o r e s c e n tp r o t e i n ， E G F P ) 報告 基因 的融 合 蛋 白真 核表

21、 達 質(zhì)粒 ， 并檢 測其 在 MS C中的表 達 。維普資訊 http://www.cqvip.com I234M 一 ’_ I ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． 一腳 ! J h t j-? ? t &#

22、168; ¨ i 一 -l ¨ I If( 一 nI l I?wi l | _ffF【 ¨ IcI I iM ： 1一^ H l l 】、 ?_ l | hr ． 【 【 1I ． n’一 {I ／H fI十，Ⅲ I I I2 ： I , F ； l3 ' 1 一 I -： 1 ' ¨I 一H一 ^I十～，I I I4i ’ fH{“ fI『 {圊 2p E G F P —l 和

23、H 產(chǎn) 物的 ⅢR ¨ ⅡB 刪 l I I 酶切 圉 4 體外培養(yǎng) 的 M s c形態(tài)學 觀察 代 圩 離 ¨細心 ， 46l l 后 l ¨ 婧帖， 多紼形和 則『 j _ ； (5 ) 34t i行 ? 胞 鞋落 長 匿 漸臺成 片． ?I24書鋪 滿晦 傳代『 也 舒較均 J旱船下? I掩多舶胞漿 較 勻l5lr 】 1 1 14L r VM l 、 【 aT cr7urc I I Iif &#

24、215; I ?¨圖 5 培 養(yǎng) 7 2 1 1 的原 代 M軋 5E GF P ／ VE GF蛋 白 表 達 檢 測 晰f質(zhì) 牲物J i I 『 凡 M． 部 圩卦 H 胞兒 坨砸廣 ． 眥轉(zhuǎn) 4 8l 17 I l 呲 光顯儆 鏡 ．r i gn n II 1l目 l Ⅶ4f _ = ¨ n ?、【} If_ ln 、n ， ¨ 2 1‘n 】¨】『 J lJI I I】圖 4p E

25、G F ] ' ~ V E G F I 2 1 的 脅 一I 和 B c u n H T 雙酶 切 鑒定 IⅢ ( ’ Hll 1 “? l 1lcⅥ 0 { x J ㈨ j圖 6 傳代 4 8 h后 MS C 的 HE染 色4 8 8- u -激 發(fā)池 K5 0 7 - ¨ n制波 K帆寮 到 轉(zhuǎn) 染p l： f 川 Ⅵ ．I 2 1 的 M 州 鞍 茫的 綠 色 熒 光 ( 罔7 ) ， 求轉(zhuǎn)鞋 細胞 尤