乙草胺微生物降解途徑中關(guān)鍵酶基因克隆與酶學(xué)特性研究.pdf

1、氯代乙酰胺類除草劑因分子結(jié)構(gòu)中具有酰胺基團(tuán)(CONH-)而得名，因其高效、高選擇性而在全球范圍內(nèi)廣泛使用。乙草胺[2'-乙基-6'-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代-N-乙酰苯胺]是氯代乙酰胺類除草劑的重要代表，主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。乙草胺的主要生物降解產(chǎn)物為2-氯-N-(2'-甲基-6'-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)和2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)，研究表明殘留在環(huán)境中的乙草胺及其降解中間產(chǎn)物對(duì)環(huán)境和農(nóng)業(yè)

2、生態(tài)系統(tǒng)都具有一定的危害。
　　本實(shí)驗(yàn)室以乙草胺為靶標(biāo)，篩選到一株能將乙草胺轉(zhuǎn)化為CMEPA的菌株Rhodococcus sp.T3-1和一株能將CMEPA水解為MEA的菌株Delftia sp.T3-6。本文以Rhodococcus sp.T3-1為材料，對(duì)乙草胺N-脫乙氧甲基酶（簡(jiǎn)稱N-脫烷基酶）基因進(jìn)行克隆，以Delftia sp.T3-6為材料，對(duì)CMEPA水解酶基因進(jìn)行克隆，并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　快

3、速有效的酶活測(cè)定方法是蛋白質(zhì)純化的前提，本論文首先建立了一種快速測(cè)定CMEPA水解產(chǎn)物MEA的方法。在20 mM Tris-HCl(pH7.0)緩沖液中，10-50μM的2，6-甲乙基苯胺在鐵氰化鉀催化下與4-氨基安替比林反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在535 nm的吸光值與MEA濃度有良好的線性關(guān)系，底物CMEPA、SDS、甲醇等有機(jī)試劑、1mM的金屬離子對(duì)顯色反應(yīng)無(wú)顯著影響。溫度和pH對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著。該方法也適用于其它苯胺苯酚類衍生

4、物的測(cè)定。
　　通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Butyl-650M疏水層析和Superdex G-200凝膠層析4步純化流程，獲得達(dá)電泳純的目的蛋白(DamH)。純化倍數(shù)為17.7倍，蛋白回收率為0.29％。肽指紋分析得到兩條肽段APEADDELRR和TNPLANPLKASYQGFPR，N端測(cè)序15個(gè)氨基酸序列為Gly-Thr-Ser-Pro-Gln-Ser-Asp-Phe-Leu-Arg-Ala-

5、Leu-Phe-Gln-Ser.
　　根據(jù)N端氨基酸序列及肽指紋圖譜設(shè)計(jì)引物，利用染色體步移技術(shù)克隆到Delftiasp.T3-6 CMEPA水解酶編碼基因damH，該基因全長(zhǎng)903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，分子量為32 kDa，與來(lái)源于Acinetobacter sp.SE19的環(huán)已醇降解基因簇的ChnC一致性為67％。構(gòu)建表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)-(pET-29a(+)-damH)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，實(shí)現(xiàn)重組酶D

6、amH在E.coli BL21(DE3)中的異源表達(dá)。DamH是一個(gè)具有酯類水解活性的酰胺水解酶，在以CMEPA為底物時(shí)比活力為5036 U/mg，在以4-硝基苯酯為底物時(shí)比活力為612 U/mg。DamH最適底物為CMEPA，其Km和kcat值分別為0.197 mM和2804.32 s-1。DamH具有催化芳基酰胺類化合物水解和對(duì)硝基苯酯類、三酰甘油酯和ε-已內(nèi)酯水解的能力，最適酶反應(yīng)pH為6.5，最適酶反應(yīng)溫度為35℃。Mn2+離子

7、對(duì)酶活有促進(jìn)作用，Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+對(duì)酶活有抑制作用;PMSF、SDS強(qiáng)烈抑制酶的活性，而EDTA和DMSO對(duì)酶活影響較小。
　　定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DamH活性中心可能由S149-E244-H274三聯(lián)體結(jié)構(gòu)組成，除活性中心構(gòu)成外，三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果也顯示DamH與酯酶3FAK類似，具有一個(gè)典型的Gly-X-Ser-X-Gly保守序列和S149，E244，H274三聯(lián)體催化中心以及HGX結(jié)構(gòu)(79HGG81)。

8、DamH在蛋白濃度為15 mg/mL，結(jié)晶池母液為:0.2M乙酸銨，pH7.1，21％ PEG3350，坐滴氣相擴(kuò)散法20℃下約18天能長(zhǎng)出衍射能力達(dá)3.4(A)的晶體。
　　乙草胺的降解首先要進(jìn)行N-脫乙氧甲基，生成CMEPA進(jìn)而被DamH水解為MEA。該過(guò)程由乙草胺N-脫烷基酶催化完成，乙草胺N-脫烷基酶性質(zhì)非常不穩(wěn)定，普通的超聲波破碎法會(huì)導(dǎo)致酶快速失活。本論文首先研究了細(xì)胞破碎提取乙草胺N-脫烷基酶粗酶液的方法和測(cè)活體系，建

9、立了以液氮研磨方法制備Rhodococcus sp.T3-1粗酶液的方法，在含1 mM NADH+H+，40％蔗糖，0.1 M NaCl，10 mM MgCl2，2 mMβ-巰基乙醇的20 mM Tris-HCl(pH7.0)緩沖液中，利用粗酶液和DamH兩步催化形成MEA，利用顯色法可間接檢測(cè)到乙草胺N-脫烷基酶活性。
　　通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析從Rhodococcus sp.T3-1粗酶液中分離到三個(gè)蛋白，肽指紋圖譜結(jié)果