色氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建及耐酸性研究.pdf

1、L-色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸，廣泛應(yīng)用于飼料和醫(yī)藥方面。本研究依據(jù)代謝工程理論，以L(fǎng)-色氨酸工程菌TRTH為出發(fā)菌株，構(gòu)建L-色氨酸高產(chǎn)菌。
　　tktA基因編碼的轉(zhuǎn)酮醇酶在磷酸戊糖途徑中生成4-磷酸赤蘚糖起主要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，將兩種啟動(dòng)子控制的tktA基因整合至假基因位點(diǎn)ybfG處，獲得菌株TRTH(ΔybfG∷Ptrc1-tktA)和TRTH(ΔybfG∷Ptrc2-tktA)。
　　通過(guò)30 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)

2、驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株TRTH(ΔybfG∷Ptrc1-tktA)L-色氨酸產(chǎn)量36.2 g/L，相比較于菌株TRTH(32.2 g/L)產(chǎn)量提高12.4％。而菌株TRTH(ΔybfG∷Ptrc2-tktA)L-色氨酸產(chǎn)量12.3 g/L，相比較于菌株TRTH下降61.8％。發(fā)酵結(jié)果表明適當(dāng)增強(qiáng)tktA基因表達(dá)量能夠增加L-色氨酸前體物E4P的合成，減少耗糖量提高L-色氨酸產(chǎn)量。
　　將將解除了反饋抑制的基因trpEfbrD整合至假基

3、因位點(diǎn)處構(gòu)建菌株TRTH(ΔybfG∷Ptrc-trpEfbrD)。發(fā)酵結(jié)果顯示TRTH(ΔybfG∷Ptrc-trpEfbrD)L-色氨酸產(chǎn)量為29.3 g/L，比出發(fā)菌TRTH降低9.3％。這表明L-色氨酸工程菌質(zhì)粒本身所帶有的L-色氨酸合成相關(guān)基因表達(dá)量已足夠。
　　以增加NADPH為目的，將gapC基因替換大腸桿菌自身基因gapA構(gòu)建了菌株TRTH(ΔgapA∷PgapA-gapC)。發(fā)酵L-色氨酸最終產(chǎn)量為37.5 g/

4、L，相較于TRTH(32.2g/L)，增加15.4％。說(shuō)明通過(guò)增加NADPH的供應(yīng)量對(duì)提高L-色氨酸產(chǎn)量和減少乙酸有正向效果。
　　菌株TRTH生產(chǎn)L-色氨酸時(shí)，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，容易染菌，若將培養(yǎng)基pH降低可減少生產(chǎn)過(guò)程中染菌的機(jī)率。構(gòu)建了耐酸性菌株TRTH(ΔaraBAD∷Para-arcA)和TRTH(ΔaraBAD∷Para-gadBC)。
　　將菌株TRTH(ΔaraBAD∷Para-arcA)分別在pH5.5、6.0