一株新的羽毛角蛋白降解菌的鑒定、研究與應(yīng)用.pdf

1、角蛋白作為一種硬性蛋白，具有不溶于水和抗分解的性質(zhì)，一般條件下不溶解，且不能被一般的蛋白酶水解，這給角蛋白的處理提出了難題。我國的角蛋白資源極其豐富，它們大部分沒有被充分利用，有的甚至造成環(huán)境污染。而近年來畜牧業(yè)及氨基酸工業(yè)的大力發(fā)展使得蛋白資源極其緊缺，因此，當(dāng)前應(yīng)大力研究最有效的處理方法使廢棄的羽毛角蛋白直接轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)或復(fù)合氨基酸，使之能直接得到應(yīng)用或作為進一步提純氨基酸的廉價易得的原料，從而變廢為寶，既保護環(huán)境又資源利用，這將具

2、有十分顯著的經(jīng)濟效益和深遠的社會效益。本課題針對羽毛角蛋白廢棄物的資源化利用，進行了以下的研究。 首先對從堆積腐爛羽毛的土壤中分離得到能高效降解羽毛角蛋白的細菌KI進行形態(tài)觀察和16S rRNA測序。初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)，與嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)相似性達98％，命名為嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltoph

3、ilia DHHJ)。迄今為止，國內(nèi)還未見寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)降解羽毛角蛋白的相關(guān)報道。 通過對分離于長期堆積腐爛羽毛土壤中的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)進行紫外誘變，在最佳照射時間90 s下，經(jīng)過一系列篩選方法，得到一株高效的突變菌株L4。該突變菌株接種于含有滅菌處理過的完整羽毛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，發(fā)酵1天后即可見羽毛有明顯脫落，發(fā)酵6天后

4、羽毛已經(jīng)完全脫落，羽梗也有一定程度的毀解，降解率可達80％，比原始菌株提高了20％。發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量最大可達7.05mg/mL，酶活力最大為8U/mL，氨基酸含量最大為0.19mg/mL，這表明突變菌株L4具有較強降解羽毛角蛋白的能力。 原始嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)產(chǎn)生的粗酶液最適作用pH為7.5，最適作用溫度為40℃，在pH6.5～8.0，40℃以下酶活較穩(wěn)

5、定。突變菌株L4粗酶液的最適作用pH為7.8，最適作用溫度為50℃，在pH7.0～8.0，60℃以下酶活較穩(wěn)定。 Ca2+，Ba2+，Cu2+，Na+，K+和Mg2+離子對粗酶活力有促進作用，而Hg2+，Cd2+，Pb2+，Zn2+和PMSF則對粗酶活力有抑制作用。由于其被PMSF所抑制，可認為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)產(chǎn)生的角蛋自酶應(yīng)屬于絲氨酸蛋自酶。對粗酶

6、液進行了SDS-PAGE電泳，測定該角蛋白酶可能為復(fù)合酶，由兩個亞基構(gòu)成，大小分別為141kD和119kD。 初步研究了嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)降解角蛋白的機理。電鏡觀察到細菌緊密地生長在羽枝上，在96 h左右完全降解羽毛。生物化學(xué)研究顯示嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophiliaDHHJ)產(chǎn)生具有角蛋白降解能力的胞外酶

7、。胞外酶的角蛋白水解活性(5.5U)受到胞內(nèi)二硫鍵還原酶的促進(16.3U)。但是，單獨的角蛋白酶和二硫鍵還原酶在沒有活的細菌存在下，都不能降解羽毛。這說明細菌附著在降解過程中起了重要的作用。這可能是由于細菌持續(xù)提供了一種還原劑破壞二硫鍵。此外，在羽毛降解過程中，在胞外酶中還檢測到亞硫酸鹽，說明亞硫酸鹽解對羽毛降解也起了一定的作用。 固定化技術(shù)是提高生物催化利用率、生物反應(yīng)速率以及實現(xiàn)高效連續(xù)生產(chǎn)過程的有效方法。本課題研究了殼聚

8、糖表面吸附法固定嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)進行羽毛降解。由于其具有使用壽命長，具有足夠的韌性、強度和一定的生物相容性，易回收，降解效果穩(wěn)定等特點，因此是值得致力研究的方向。 提出了羽毛角蛋白微生物水解的工藝，并借鑒垃圾堆肥和活性生物滴濾池技術(shù)，設(shè)計了羽毛水解裝置。將經(jīng)過加熱預(yù)處理的羽毛作為“填料”，放置于羽毛反應(yīng)器的中段，讓高效菌株在其中生長代謝，使無機培養(yǎng)液從