納米金技術(shù)檢測(cè)痕量二惡英類化合物的方法學(xué)研究.pdf

1、納米金(goldnanoparticle)是指直徑在1-100nm之間的微小金顆粒。在過(guò)去40多年來(lái)，納米金顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)以及生物標(biāo)記等生物技術(shù)中。通過(guò)在納米金顆粒表面標(biāo)記上特定的寡核苷酸探針以及對(duì)納米金顆粒表面特性的處理，開發(fā)出了一系列新的生物檢測(cè)系統(tǒng)。利用納米金顆粒的表面特性并結(jié)合靈敏的表面讀數(shù)設(shè)備建立的Scanometric分析方法，可以檢測(cè)到樣本中痕量的核酸分子而不需要PCR的擴(kuò)增。利用表面標(biāo)記有barcode

2、DNA和特異性配體的納米金顆粒特異性識(shí)別相應(yīng)的生物分子，并通過(guò)磁珠或者其它方式洗脫未結(jié)合的納米顆粒探針，最后通過(guò)檢測(cè)納米顆粒上barcodeDNA的量來(lái)反映目標(biāo)分子的量，這就是“生物條形碼”技術(shù)，已在多種痕量蛋白和核酸分子的超敏檢測(cè)中應(yīng)用。 二惡英類化合物(Dioxin-LikeChemicals，DLCs)是包括多氯代二苯并二惡英(polychlorinateddibenzo-p-dioxins，PCDDs)，多氯代二苯并呋

3、喃(polychlorinateddibenzofurans，PCDFs)和共平面多氯聯(lián)苯(polychlorinatedbiphenyls，PCBs)等一大類化合物的總稱。DLCs毒性高，在環(huán)境中分布廣泛，且不容易降解，具有生物富集和生物放大等特性，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重的危害，急需加強(qiáng)對(duì)其的監(jiān)測(cè)。高分辨氣相色譜－高分辨質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)(highresolutionchromatographycombinedwithhigh-res

4、olutionmassspectrometry，HRGC/HRMS)被認(rèn)為是二惡英類化合物定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。但該方法費(fèi)時(shí)且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，因此，對(duì)于能夠快速、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)DLCs的存在，并能準(zhǔn)確地反映DLCs總體機(jī)體效應(yīng)的生物檢測(cè)方法就顯得十分必要了。 本研究首先建立了一個(gè)基于納米金技術(shù)的痕量核酸分子定量檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)到樣本中痕量的目的核酸分子；然后在此方法的基礎(chǔ)上，引入納米金顆粒標(biāo)記的含二惡英反應(yīng)元件(DRE)核心序列的雙

5、鏈核酸探針，根據(jù)DLCs生物學(xué)作用機(jī)制，TCDD體外誘導(dǎo)芳香烴受體(arylhydrocarbonreceptor，AhR)產(chǎn)生變構(gòu)，形成TCDD-AhR-DRE復(fù)合物，在Arnt單克隆抗體的特異性捕獲下，該復(fù)合物被固定于固相載體上，最后通過(guò)納米金Scanometric檢測(cè)方法建立了一種新的DLCs生物檢測(cè)技術(shù)。 第一部分：納米金技術(shù)檢測(cè)痕量核酸分子 目的：本部分旨在建立一種新的基于納米金技術(shù)的痕量核酸分子定量檢測(cè)方

6、法。 方法：納米金核酸探針，生物素捕獲探針和目的序列在一定的離子濃度和溫度條件下孵育一定時(shí)間后，雜交形成一個(gè)一端標(biāo)記有納米金顆粒，一端標(biāo)記有生物素的雙鏈DNA。該雜交產(chǎn)物隨后被轉(zhuǎn)移至親和素包被的酶標(biāo)板中，通過(guò)生物素－親和素系統(tǒng)固定于酶標(biāo)板中。分別用1×PBS和2×PBN溶液洗滌去除游離的納米金探針后，用銀染增強(qiáng)液處理，銀染增強(qiáng)液中的銀離子以納米金顆粒為核心聚集在納米金顆粒的表面，在還原劑的作用下還原成銀原子，使得納米金的信號(hào)得

7、到放大。通過(guò)酶標(biāo)儀在630nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，可得到相應(yīng)的溶液吸光度值(OpticalDensity，OD值)。溶液OD值變化的快慢程度與納米金顆粒量的多少相關(guān)，而納米金顆粒的量與目的DNA片段的濃度相關(guān)，據(jù)此可以建立一個(gè)目的DNA的濃度與溶液OD值的劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線。 結(jié)果：(Ⅰ)在一定的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，溶液的OD值與溶液中目的序列的濃度相關(guān)。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，目的序列的濃度越高，溶液OD值的變化越明顯，而在沒有目的序列的陰性

8、對(duì)照中，溶液的OD值無(wú)明顯變化。(Ⅱ)定量研究可以得到目的序列濃度－效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定范圍內(nèi)(10-16～10-12mol/l)，在相同的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，目的序列的濃度與溶液的OD值之間呈高度的線性相關(guān)，R2=0.9713。利用這種方法能夠檢測(cè)到的單鏈目的序列的最低濃度是100aM。(Ⅲ)對(duì)于含目的序列的雙鏈DNA，其檢測(cè)過(guò)程類似于單鏈檢測(cè)過(guò)程，而且同樣可以得到類似于單鏈目的DNA的濃度－效應(yīng)關(guān)系曲線。由于雙鏈DNA的特殊性，該方法對(duì)于雙

9、鏈DNA序列能夠檢測(cè)到的最低濃度是10fM。 結(jié)論：核酸分子的納米金檢測(cè)法不僅靈敏特異，而且直觀快速，儀器設(shè)備方便易操作，是一種靈敏實(shí)用的痕量核酸分子分析方法。 第二部分：納米金技術(shù)檢測(cè)痕量二惡英類化合物 目的：本部分在于探索建立一種新的基于納米金技術(shù)的TCDD定量檢測(cè)方法。 方法：2,3,7,8-TCDD與含有Ah受體和Arnt蛋白的SD大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)在20℃水浴環(huán)境中孵育一定時(shí)間后，激活A(yù)h受

10、體，形成2,3,7,8-TCDD-AhR-Arnt復(fù)合物。復(fù)合物中的Ah受體構(gòu)像發(fā)生改變，暴露出與納米金標(biāo)記的雙鏈DRE探針結(jié)合位點(diǎn)，形成2,3,7,8-TCDD-AhR-Arnt-DRE復(fù)合物。在Arnt單克隆抗體的特異性捕獲下，該復(fù)合物固定于酶標(biāo)板上。用1×PBS溶液和2×PBN溶液洗滌去除酶標(biāo)板中的游離探針后，用銀染增強(qiáng)液處理，并在630nm波長(zhǎng)處實(shí)時(shí)檢測(cè)溶液的OD值。溶液OD值變化的快慢程度與納米金顆粒量的多少相關(guān)，而納米金顆粒

11、的量與TCDD的濃度相關(guān)。根據(jù)TCDD濃度與OD值之間的關(guān)系，繪制出相應(yīng)的時(shí)間－效應(yīng)曲線和劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線。 結(jié)果：(Ⅰ)在一定的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，溶液的OD值與TCDD的濃度相關(guān)。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，TCDD濃度越高，溶液OD值的變化就越明顯，而在沒有TCDD的陰性對(duì)照中，溶液OD值則無(wú)明顯變化。(Ⅱ)定量研究可以得到TCDD劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定的濃度范圍內(nèi)(10-14～10-8mol/l)，在一定的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，溶液的OD值與

12、TCDD的濃度之間呈高度的線性相關(guān)，R2=0.9731。利用這種方法能夠檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)的2,3,7,8-TCDD的最低濃度是10fM。(Ⅲ)與其他的各種生物檢測(cè)方法一樣，納米金技術(shù)檢測(cè)二惡英方法評(píng)價(jià)的是TCDD的毒性當(dāng)量(TEQs)。該方法的檢測(cè)限比較低，比其他生物方法低100倍以上，且重復(fù)性好。 結(jié)論：納米金技術(shù)檢測(cè)TCDD具有靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，是一種新穎而實(shí)用的TCDD的快速篩選的方法。 本研究將納米生