多功能醫(yī)學(xué)顯影探針的自組裝途徑構(gòu)建及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、包括光學(xué)成像、磁共振成像（MRI)、超聲成像（US)、C T成像等多種方式在內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)顯影手段在臨床疾病診斷中發(fā)揮著日益重要的作用。在實(shí)際應(yīng)用中，將具有互補(bǔ)特點(diǎn)的顯影方式結(jié)合進(jìn)行多重顯影診斷對(duì)于提高疾病準(zhǔn)確率具有重要意義；而分子顯影探針的運(yùn)用更是將醫(yī)學(xué)顯影推動(dòng)到分子診斷的水平。在分子造影探針的設(shè)計(jì)構(gòu)建中，為了達(dá)到多種互補(bǔ)性成像方式共同顯影的目的，可將敏感度較高的分子造影探針（如超聲造影探針、光學(xué)造影探針、PET造影探針）與空間分辨率高

2、的分子造影探針（如 M RI造影探針、C T造影探針）通過化學(xué)鍵連接。但由于不同目的的顯影探針往往在結(jié)構(gòu)和組成上差別很大，這種直接結(jié)合的方式經(jīng)常面臨制備過程復(fù)雜，適用領(lǐng)域受限等問題。而自組裝的途徑則可以靈活地通過非共價(jià)鍵力將多種具有截然不同性質(zhì)的組分有效結(jié)合，從而為多功能醫(yī)學(xué)造影探針的構(gòu)建提供了一個(gè)廣闊的平臺(tái)。雖然如此，目前相關(guān)領(lǐng)域研究仍然并不多見，尤其是可用于診斷特定分子結(jié)構(gòu)的多重顯影探針更未見報(bào)道。基于此，本研究集中于設(shè)計(jì)新穎的自組

3、裝途徑構(gòu)筑具有多重顯影性能的醫(yī)學(xué)顯影探針，將其拓展到分子水平的顯影診斷，并探索其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。具體主要在如下方面開展了工作。
　　(1)用新穎的無模板自組裝法構(gòu)建聚合物/Fe3〇4磁性納米顆粒復(fù)合微囊，由于內(nèi)部富含超順磁性納米顆粒，該微囊具備MRI顯影增強(qiáng)性能。在此基礎(chǔ)上，通過微囊內(nèi)部充填全氟己烷得到具備MRI/超聲雙重顯影增強(qiáng)性能的顯影微泡，并對(duì)微囊及微泡的制備過程、形成機(jī)理及顯影性能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。我們的研究表明，微囊壁為

4、“聚烯丙基胺/Fe3O4磁性納米顆粒/聚丙烯酸聚合物”三明治結(jié)構(gòu)，微囊直徑可以通過改變自組裝前驅(qū)物的比例在450 n m至1300 n m范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在微囊內(nèi)部充填全氟己烷后，所得聚合物/Fe3O4磁性納米顆粒復(fù)合微泡具有良好的超聲/磁響應(yīng)性，并表現(xiàn)出良好的體外磁共振/超聲雙重顯影增強(qiáng)性能，顯影強(qiáng)度與微泡尺寸和組成相關(guān)，微泡尺寸越大，超聲造影強(qiáng)度越高，而其中的磁性顆粒含量越低，從而磁共振造影強(qiáng)度相對(duì)較弱。
　　(2)對(duì)微囊及微

5、泡的細(xì)胞毒性和體內(nèi)超聲/磁共振雙重顯影性能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。研究表明，自組裝方法構(gòu)建的聚合物/Fe3〇4磁性納米顆粒復(fù)合微囊對(duì)于大鼠BRL3A肝細(xì)胞和NRK腎細(xì)胞均具有良好的生物相容性。在大鼠體內(nèi)，聚合物/Fe3O4納米顆粒復(fù)合微泡能夠在肝臟中進(jìn)行磁共振/超聲雙重顯影。肝臟中的MRI造影增強(qiáng)在45天內(nèi)消失，說明復(fù)合微泡在45天內(nèi)于肝臟中代謝完全。復(fù)合微泡在大鼠肝臟中的超聲造影增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間為10min。經(jīng)普魯士藍(lán)染色，確定聚合物/Fe3O4

6、納米顆粒復(fù)合微泡最先分布在大鼠肝臟內(nèi)，并在15天內(nèi)部分轉(zhuǎn)移至脾臟內(nèi)，從而明確了復(fù)合微泡在大鼠體內(nèi)的代謝途徑為肝臟-脾臟常規(guī)代謝途徑。
　　(3)為了構(gòu)筑可用于胰蛋白酶檢測(cè)的光學(xué)/磁共振雙重顯影分子探針，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了一種自組裝途徑，以近紅外熒光分子（Cy5.5)-聚左旋賴氨酸（PLL)和Fe;O4磁性納米顆粒為主要組份制備了對(duì)于胰蛋白酶具有響應(yīng)性顯影性能的自組裝復(fù)合微球，并對(duì)微球的制備機(jī)理和性能調(diào)控進(jìn)行了系統(tǒng)研究。我們的研究證實(shí)，微

7、球的直徑可以通過調(diào)節(jié)各組分的摩爾比或PLL的分子量而在100nm-300nm范圍間調(diào)節(jié)。Cy5.5-PLL/Fe3O4磁性納米顆粒復(fù)合微球在無蛋白酶存在時(shí)，微球內(nèi)的近紅外熒光分子相互間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，熒光淬滅，微球M RI造影性能較強(qiáng)；而在胰蛋白酶活化的狀態(tài)下，微球內(nèi)的PLL發(fā)生酶切反應(yīng)，從而使得熒光分子間距離增加，使得復(fù)合微球處于“解淬滅”狀態(tài)而釋放出強(qiáng)烈熒光，并帶來M RI顯影信號(hào)的降低。這種對(duì)于蛋白酶敏感的“淬滅”-“解淬滅”轉(zhuǎn)

8、變使得復(fù)合微球在蛋白酶過表達(dá)相關(guān)的疾病診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　(4)在成功構(gòu)建胰蛋白酶敏感的熒光/MRI雙顯影自組裝微球的基礎(chǔ)上，本論文對(duì)微球的細(xì)胞毒性、胰蛋白酶敏感的體外顯影和活體顯影性能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。復(fù)合微球的細(xì)胞毒性與體外顯影性能的研究選取胰蛋白酶表達(dá)的細(xì)胞（如胃上皮細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和結(jié)腸癌SW620細(xì)胞）與不含胰蛋白酶的對(duì)照組細(xì)胞（如血管上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，宮頸癌Hela細(xì)胞和黑色素瘤A375細(xì)胞）

9、。研究表明，自組裝Cy5.5-PLL/Fe3O4納米顆粒微球具有良好的生物相容性。在胰蛋白酶表達(dá)的細(xì)胞組中，復(fù)合微球表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光顯影性能，同時(shí)具備M RI造影性能；在不含胰蛋白酶的對(duì)照細(xì)胞組中，復(fù)合微球不表達(dá)熒光顯影性能，并具有較弱的M RI顯影強(qiáng)度。胰蛋白酶敏感的活體顯影性能選用對(duì)照組正常裸鼠、胰蛋白酶過表達(dá)的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞腫瘤模型，和不含胰蛋白酶的黑色素瘤A375細(xì)胞腫瘤模型進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，Cy5.5-PLL/Fe

10、3O4納米顆粒復(fù)合微球在裸鼠體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)消化道顯影，并在腫瘤模型的腫瘤部位具備胰蛋白酶敏感的熒光/M RI顯影性能。在SW620腫瘤模型中，腫瘤部位發(fā)出近紅外熒光并顯示較強(qiáng)的M RI造影；在A375腫瘤模型中，腫瘤部位不發(fā)射熒光并顯示較弱的M RI造影。進(jìn)一步的生物TEM觀測(cè)證明微球在SW620腫瘤模型中，部分被腫瘤細(xì)胞攝取并于胞內(nèi)水解為單分散的納米顆粒，而在A375腫瘤模型中卻極少被腫瘤細(xì)胞攝取。復(fù)合微球在裸鼠體內(nèi)的生物毒性較低，是一種

11、很有潛力的胰蛋白酶敏感近紅外熒光/MRI智能造影探針。
　　在以上研究內(nèi)容中，我們?nèi)〉昧艘韵聞?chuàng)新的研究結(jié)果：設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了由靜電作用驅(qū)動(dòng)的無模板自組裝途徑，構(gòu)筑了具備MRI/超聲雙重顯影性能的微泡，在體內(nèi)血管MRI/超聲雙重造影檢測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值；巧妙地將酶敏感組分引入組裝體，首次利用自組裝途徑制備了胰蛋白酶敏感的近紅外熒光/MRI雙重顯影探針，將多重顯影探針的辨識(shí)度提高到分子水平，預(yù)期在胰蛋白酶敏感的腫瘤檢測(cè)和消化道顯影中