納米生物探針的制備及蛋白質(zhì)檢測應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)免疫分析在生命分析研究領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)的意義，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷等方面。傳統(tǒng)的免疫分析方法在一些特殊需要領(lǐng)域如疾病早期診斷等受到了很大限制，研究和建立靈敏度高、低耗、高效、可操作性強的蛋白質(zhì)免疫分析體系日趨迫切。針對這一研究目的，本文圍繞納米材料的合成、納米生物探針的制備以及對蛋白質(zhì)的靈敏檢測方法的建立等方面展開，合成了一系列尺寸均一，分散性良好，性質(zhì)穩(wěn)定的納米粒子，并將它們與抗體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備成納米生物探針，用于

2、對蛋白質(zhì)的靈敏檢測，得到了一系列有益效果。具體研究內(nèi)容如下:
　　 (1)用反相微乳法合成了尺寸均一的Ru(bpy)32+摻雜的SiO2(SiO2@Ru)納米球，并將其作為標(biāo)記物用來標(biāo)記模型蛋白質(zhì)甲胎蛋白(AFP)的抗體制備成納米生物探針，再通過夾心免疫過程將納米生物探針捕獲到金絲電極表面，用電致化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測方法實現(xiàn)了AFP的靈敏檢測。SiO2外殼不僅可以很好的保持Ru(bpy)32+的物理化學(xué)性質(zhì)，還可以有效阻止內(nèi)容

3、物的泄露，而且由于一個SiO2小球中可以包裹多個Ru(bpy)32+分子，使檢測的靈敏度與傳統(tǒng)方法相比有較大程度的提高。在0.01-20 ng mL-1的濃度范圍內(nèi)，ECL信號強度與AFP濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限可達(dá)0.035 ng mL-1(S/N=3)。
　　 (2)量子點(QDs)直接作為生物標(biāo)記物存在易團(tuán)聚、難分離等缺陷，且熒光強度易受其本身顆粒大小和分散狀態(tài)的制約等局限，為了解決這些問題，利用單分散SiO2納米球

4、作為量子點的載體，實現(xiàn)了CdTe QDs在其表面的均勻包覆(Si/Cd)，并將其與抗體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備成納米生物探針。基于CdTe QDs特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建了一種可用電致化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)和熒光分析三種方法檢測的免疫傳感體系。利用多種表征手段對電極的修飾和夾心免疫反應(yīng)過程進(jìn)行了表征。電致化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)和熒光分析所得的檢測信號與模型蛋白質(zhì)(免疫球蛋白G，IgG)的濃度之間存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為 IECL=-1343+2

5、468log(c/pg mL-1),Ip/μA=-4.57+5.45log(c/pg mL-1)和I=-25.19+22.57log(c/pg mL-1);線性范圍分別為5 pg mL-1-10 ng mL-1、10 pg mL-1-10 ngmL-1和50 pg mL-1-10 ng mL-1;三者的檢出限分別為1.3 pg mL-1、0.6 pg mL-1和12 pgmL-1(S/N=3)。電致化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)檢測信號與CdTe Q

6、Ds直接標(biāo)記的免疫傳感體系相比，分別放大了6.6和5.9倍。
　　 (3)通過實驗條件的摸索和優(yōu)化，合成了粒徑在5 nm左右的金納米粒子(AuNPs)，將CdTe QDs與AuNPs分別標(biāo)記癌胚抗原(CEA)的多克隆和單克隆抗體，通過夾心免疫反應(yīng)實現(xiàn)了CdTe QDs與AuNPs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，并用熒光免疫分析方法對模型腫瘤標(biāo)志物CEA進(jìn)行了定量的濃度檢測。在1-110 ng mL-1的濃度范圍內(nèi)，熒光能量轉(zhuǎn)

7、移效率E與CEA濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為logE=-1.3602+0.5240log(c/ng mL-1)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9912，檢出限為0.3 ngmL-1(S/N=3)。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比，本方法可用于腫瘤標(biāo)志物的靈敏、可視化檢測，充分顯示出其操作簡單可控、無需大型儀器和昂貴設(shè)備的優(yōu)勢，并且可以在同一批次高通量檢測多個待測樣品，節(jié)省了檢測時間和檢測成本，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　 (4

8、)單指標(biāo)腫瘤標(biāo)志物檢測在具體操作時存在血清用量大，患者費用高等缺陷，同時檢測與統(tǒng)一疾病相關(guān)的標(biāo)志物組合，可以有效提高腫瘤檢測的陽性率和特異度，同時能夠減少檢測時間，降低檢測成本，提高診斷的準(zhǔn)確性。為了達(dá)到同時檢測的目的，合成了尺寸規(guī)整、性質(zhì)穩(wěn)定的水溶性CdSe和PbS QDs，并將它們分別包覆在SiO2表面制備成CdSe@SiO2和PbS@SiO2復(fù)合納米粒子。進(jìn)一步，將CdSe@SiO2和PS@SiO2復(fù)合納米粒子與抗體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備