茶樹萜類前體合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、植物萜類代謝譜包含初生代謝物和次生代謝物，其構(gòu)成直接影響植物生長發(fā)育和抗性。植物萜類前體合成途徑結(jié)構(gòu)酶異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)和牻牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶(GGPPS)，以小家族的形式存在，其家族成員間的分工與合作決定了萜類前體的合成與分布，直接影響萜類代謝譜的構(gòu)成。本文以‘龍井43’（Camellia sinensis cv.Longjing43）為材料，通過RACE-PCR和RT-PCR法克隆目

2、的基因序列。綜合目的基因組織表達(dá)模式分析、編碼蛋白生物信息學(xué)分析以及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果預(yù)測目的基因編碼蛋白的催化功能。主要結(jié)果如下:
　　1.克隆得到異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶和異戊烯基焦磷酸合酶這2個(gè)亞家族的9個(gè)目的基因序列，包括2個(gè)IPPI基因序列、2個(gè)FPPS基因序列、5個(gè)GGPPS基因序列，其中GGPPS9基因存在3條等位基因序列(CsGGPPS9-1，CsGGPPS9-2和CsGGPPS9-3)。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒

3、光定量PCR(qRT-PCR)檢測目的基因組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，CsIPPI表達(dá)量較低，僅在根和成熟葉中表達(dá)量稍高，CsFPPS在茶樹葉片中表達(dá)量最高，而茶樹GGPPS基因家族的各個(gè)成員存在組織表達(dá)特異性。CsGGPPS1整體表達(dá)豐度較低，僅在一芽二葉中表達(dá)量稍高;CsGGPPS2表達(dá)豐度高于其它基因，在茶樹花中表達(dá)量與其它組織存在顯著差異;CsGGPPS3在葉和幼根中的表達(dá)量高于花，花發(fā)育過程中表達(dá)平穩(wěn); CsGGPPS4在茶樹各個(gè)組織中

4、表達(dá)量數(shù)值相近，在花發(fā)育過程中表達(dá)量變化趨勢(shì)與CsGGPPS2相同;CsGGPPS9在花中表達(dá)量高于葉片和幼根。
　　3.生物信息學(xué)分析顯示，茶樹IPPI存在Nudix結(jié)構(gòu)域，空間上表現(xiàn)為數(shù)個(gè)α螺旋環(huán)繞β折疊形成的催化口袋;FPPS和GGPPS的三維結(jié)構(gòu)包含完整的萜類合酶折疊，存在兩個(gè)富天冬氨酸基序結(jié)合烯丙基底物。萜類合酶折疊內(nèi)由α螺旋D、E和F構(gòu)成的產(chǎn)物延伸口袋中存在三層floor位點(diǎn)，位點(diǎn)上氨基酸殘基側(cè)鏈的大小決定產(chǎn)物鏈長。C

5、sFPPS1和CsFPPS2在floor1位點(diǎn)存在兩個(gè)芳香族氨基酸殘基，因此催化產(chǎn)物為FPP; CsGGPPS1和CsGGPPS2由于在floor1的位點(diǎn)存在側(cè)鏈較大的甲硫氨酸(Met)殘基，因此催化主產(chǎn)物為GGPP，是真正的GGPPS;而CsGGPPS9位于三層floor位點(diǎn)的氨基酸殘基的側(cè)鏈都較小，主產(chǎn)物是碳鏈數(shù)大于30的異戊烯基焦磷酸。CsGGPPS3和CsGGPPS4三維結(jié)構(gòu)包含完整的萜類合酶折疊結(jié)構(gòu)，含有兩個(gè)CxxxC基序，C

6、sGGPPS3無富天冬氨酸基序，為Ⅰ型GPPS.SSU，CsGGPPS4在第二個(gè)富天冬氨酸基序位點(diǎn)上最后一位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?，為Ⅱ型GPPS.SSU。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，克隆得到的CsGGPPS1、CsGGPPS2、CsGGPPS9-1、CsGGPPS9-2和CsGGPPS9-3的編碼產(chǎn)物具有催化活性。
　　4.綜合基因組織表達(dá)特性、編碼蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，推測克隆得到的茶樹GGPPS基因家族存在功能的分化。GG