納米金共振散射相關(guān)光譜及其應(yīng)用.pdf

1、熒光相關(guān)光譜是一種高靈敏的單分子探測(cè)方法,被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)的領(lǐng)域,特別是在核酸雜交檢測(cè),基因表達(dá)分析,生物分子的相互作用及細(xì)胞內(nèi)的一些生物化學(xué)過(guò)程的研究中發(fā)揮著其它方法無(wú)可替代的作用。由于大多數(shù)化合物特別是生物分子本身沒(méi)有熒光(或熒光很弱),用熒光方法(如熒光相關(guān)光譜)研究這些化合物時(shí)通常需要用熒光染料或熒光量子點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。然而,有機(jī)熒光染料的化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性較差,在某些生物應(yīng)用中受到一定的限制。另外,目前制備的熒光量子

2、點(diǎn)大都由Cd,Pb,Hg,Te,Se等有毒元素組成,不能用于生物體內(nèi)的檢測(cè)。
　　 金納米粒子由于其表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)表現(xiàn)出特殊的光學(xué)性質(zhì),如強(qiáng)的散射特性和吸收特性。另外金納米粒子生物相容性好、易于與生物分子連接的特性,是一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物探針。目前金納米探針已成功地應(yīng)用于核酸雜交檢測(cè),免疫分析以及細(xì)胞成像等領(lǐng)域?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有:比色法、紫外光譜法、散射法和動(dòng)態(tài)光散射法,這些方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。主要

3、的缺點(diǎn)在于檢測(cè)的靈敏度不高,而且都是集合的方法。本論文基于熒光相關(guān)光譜基本原理和激光共焦構(gòu)型,利用金納米粒子具有非常強(qiáng)的光散射特性,建立了共振散射相關(guān)光譜新方法(Resonance Light ScatteringCorrelation Spectroscopy,RLSCS)。將這一方法成功地應(yīng)用于金納米粒子的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)行為的研究,濃度的表征。同時(shí)應(yīng)用于DNA雜交檢測(cè)和蛋白質(zhì)的相互作用研究。主要工作包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.

4、共振散射相關(guān)光譜是基于納米粒子(如金納米粒子)的共振散射特性建立的一種單顆粒探測(cè)新方法。我們參照熒光相關(guān)光譜理論模型,將金納米粒子共振散射光近似地按照熒光相關(guān)光譜中的熒光來(lái)處理,建立了散射相關(guān)光譜的理論模型,提出了共振散射相關(guān)光譜概念?；诩す夤步箻?gòu)型,建立共振散射相關(guān)光譜探測(cè)系統(tǒng)。對(duì)該系統(tǒng)的基本參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和優(yōu)化。顯著地減小了系統(tǒng)的檢測(cè)體積(小于1飛升),提高檢測(cè)系統(tǒng)的信/背(信號(hào)/背景信號(hào))比。該系統(tǒng)能夠獲得粒徑大于15納米

5、金顆粒的共振散射相關(guān)光譜。建立的模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)很好的吻合。
　　 2.基于散射相關(guān)光譜建立了一種表征金納米粒子的平動(dòng)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散及其濃度的新方法。我們系統(tǒng)的研究了各種因素對(duì)金納米粒子的平動(dòng)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散行為的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)不同波長(zhǎng)激光照射時(shí),僅在激光波長(zhǎng)處在共振散射峰位置(納米金的共振散射波長(zhǎng)為600納米附近)時(shí),金納米粒子的轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散可以被共振散射相關(guān)光譜探測(cè)。為了證實(shí)散射相關(guān)光譜曲線中快速運(yùn)動(dòng)屬于轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散,設(shè)計(jì)了改變針孔孔徑的

6、實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)孔徑由35微米增大到110微米時(shí),其平動(dòng)擴(kuò)散時(shí)間由2.39毫秒相應(yīng)地增大到3.74毫秒；而轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散時(shí)間卻保持6.06微秒不變,這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)相吻合。基于納米粒子的平動(dòng)擴(kuò)散時(shí)間計(jì)算了納米金的動(dòng)力學(xué)半徑,其動(dòng)力學(xué)半徑與電鏡測(cè)定結(jié)果基本相吻合。從共振散射相關(guān)光譜中獲得檢測(cè)體積內(nèi)的粒子個(gè)數(shù),用已知擴(kuò)散系數(shù)的熒光染料測(cè)定共振散射相關(guān)光譜的檢測(cè)體積,據(jù)此,我們建立了金納米粒子的濃度測(cè)定方法,其測(cè)定結(jié)果與電鏡測(cè)定方法基本相吻合。研究

7、結(jié)果表明共振散射相關(guān)光譜是表征納米粒子的一種有效的新方法。
　　 3.我們將共振光散射相關(guān)光譜應(yīng)用到核酸雜交檢測(cè)中,建立均相DNA雜交探測(cè)新方法。我們首先將兩個(gè)不同片段的寡核苷酸探針通過(guò)巰基引入到納米金表面,將其與兩個(gè)片段互補(bǔ)的靶目標(biāo)DNA加入到體系中,然后用共振光散射相關(guān)光譜檢測(cè)納米金聚集體的擴(kuò)散時(shí)間和光散射強(qiáng)度來(lái)表征納米金的聚集程度。研究發(fā)現(xiàn)隨著靶目標(biāo)DNA的含量不斷增加,納米金聚集體的擴(kuò)散時(shí)間和散射光強(qiáng)度也相應(yīng)的增加。用單

8、個(gè)堿基錯(cuò)配的靶目標(biāo)DNA加入到體系中,發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)散時(shí)間和散射光強(qiáng)度也相應(yīng)的增加,但與完全互補(bǔ)的靶目標(biāo)DNA相比,其增加的程度要弱一些。該方法檢測(cè)限達(dá)到0.1 nM,與比色法相比,檢測(cè)限提高了100倍左右。研究結(jié)果表明共振光散射相關(guān)光譜能夠很好的區(qū)分DNA堿基序列,同時(shí)還可以用于DNA含量的檢測(cè),當(dāng)靶目標(biāo)DNA的濃度在0-36 nM時(shí),聚集體的擴(kuò)散時(shí)間與核酸濃度有較好的線性關(guān)系。與比色法的2-3小時(shí)相比,該方法是一種快速檢測(cè)方法,檢測(cè)時(shí)間也

9、只需要5分鐘左右。
　　 4.將納米金共振光散射相關(guān)光譜應(yīng)用于生物分子的相互作用研究。以過(guò)氧化酶-生物素與親和素相互作用為免疫反應(yīng)模型,通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中納米金聚集體的擴(kuò)散時(shí)間來(lái)確定納米金與過(guò)氧化酶生物素最佳吸附的pn值以及生物素與親和素反應(yīng)的最佳pH值。用辣根過(guò)氧化酶-生物素通過(guò)化學(xué)吸附作用修飾到納米金的表面,加入鏈霉親和素(有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn))結(jié)合生物素使得納米金偶聯(lián)在一起,通過(guò)監(jiān)測(cè)納米金聚集體的擴(kuò)散時(shí)間測(cè)定納米金的聚集程度。隨

10、著鏈霉親和素的濃度增加,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金納米粒子聚集體的擴(kuò)散時(shí)間也相應(yīng)的延長(zhǎng),當(dāng)鏈霉親和素的濃度達(dá)到65 nM時(shí)(恰好鏈霉親和素與生物素的化學(xué)計(jì)量比為1:4),聚集體的擴(kuò)散時(shí)間達(dá)到最大值。當(dāng)鏈霉親和素為260 nM和780 nM時(shí),發(fā)現(xiàn)聚集體擴(kuò)散時(shí)間反而隨著鏈霉親和素濃度的增加而減小。當(dāng)鏈霉親和素大大過(guò)量時(shí),鏈霉親和素迅速地包覆在生物素化的納米金表面,從而部分抑制了納米金的交聯(lián)。通過(guò)對(duì)納米金聚集動(dòng)力學(xué)的研究,證實(shí)了辣根過(guò)氧化酶生物素與親和素誘