NDRG2參與全腦缺血后NF-κB介導的炎癥反應.pdf

1、全球每年約有600余萬人死于腦中風，其致殘率亦居高不下，給社會和家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。大量研究表明炎癥在缺血性神經(jīng)損傷的病理進程中發(fā)揮了重要作用，加劇神經(jīng)損傷。抑制腦缺血損傷后炎性反應顯著減少神經(jīng)功能缺失，發(fā)揮腦保護作用。
　　以往對腦缺血再灌注損傷后炎性反應的研究大多聚焦于小膠質(zhì)細胞上。近年來，一些研究證實，神經(jīng)細胞中數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細胞在缺血性腦損傷后的炎性反應中發(fā)揮關鍵作用，并成為腦缺血損傷治療的新靶點。我們前期研

2、究發(fā)現(xiàn)特異性表達于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的 NDRG2在局灶性腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮關鍵作用，下調(diào)NDRG2的表達顯著抑制星形膠質(zhì)細胞活化，減少神經(jīng)細胞凋亡。但NDRG2是否參與了全腦缺血再灌注損傷后的炎性反應進程，尚需深入探討。
　　本研究旨在探索特異性表達于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的NDRG2是否參與了全腦缺血再灌注損傷后NF-κB介導的炎性反應通路，為腦缺血損傷后抗炎治療提供新的分子靶點。
　　實驗一、NDRG2和NF-κB細胞及亞細胞

3、定位
　　目的：明確NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的表達與定位
　　方法：
　　1.為明確NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)細胞定位，將6只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組和GCI組。運用免疫熒光染色檢測NDRG2和NF-κB的細胞定位情況。
　　2.為明確原代星形膠質(zhì)細胞中NDRG2和NF-κB表達及定位，利用免疫熒光染色檢測原代星形膠質(zhì)細胞中NDRG2和NF-κB的表達與定位。
　　結

4、果：
　　1.免疫熒光結果顯示，NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)分別與星形膠質(zhì)細胞特異性蛋白標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial Fibrillary acidic protein，GFAP）存在大量共標，進一步觀察發(fā)現(xiàn)NDRG2和NF-κB亦有大量重疊；與Con組相比，GCI/R組NDRG2和NF-κB共標細胞數(shù)量明顯增加。
　　2.免疫熒光結果顯示，原代星形膠質(zhì)細胞中高表達NDRG2和NF-κB；進一步觀察發(fā)現(xiàn)，NDR

5、G2和NF-κB主要集中于細胞胞質(zhì)中，與細胞核幾乎不存在共標。
　　結論：NDRG2和NF-κB高表達于海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞中，主要集中于細胞胞質(zhì)中，并存在大量共定位，在缺血損傷后共定位明顯增加。
　　實驗二、缺血損傷后NDRG2和NF-κB表達增加，炎癥因子釋放增加
　　目的：觀察缺血損傷后海馬CA1區(qū)NDRG2、NF-κB蛋白及炎癥因子表達變化
　　方法：
　　1.為檢測缺血損傷后海馬CA1區(qū)NDR

6、G2、NF-κB蛋白及炎癥因子時間表達變化，將32只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組和GCI/R組，其中GCI/R組再分為7組，即GCI/R0h、GCI/R2h、GCI/R6h、GCI/R12h、GCI/R24h、GCI/R48h、GCI/R72h。在缺血再灌注0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h取雙側(cè)海馬CA1區(qū)腦組織，用Western blot檢測NDRG2和NF-κB蛋白表達變化，用ELISA檢測炎癥因子TNF-α、

7、IL-6、IL-1β表達情況。
　　2.為檢測OGD后原代星形膠質(zhì)細胞中NDRG2、NF-κB蛋白時間表達變化及炎癥因子分泌情況，將原代星形膠質(zhì)細胞隨機分為Con組和OGD/R組，其中OGD/R組再分為OGD/R0h、OGD/R2h、OGD/R6h、OGD/R12h、OGD/R24h組。在復氧復糖0h、2h、6h、12h、24h分別收集細胞和培養(yǎng)液，用Western blot檢測NDRG2和NF-κB蛋白表達變化，用ELISA檢測

8、炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌情況。
　　結果：
　　1.Western blot結果顯示，在全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)NDRG2和NF-κB蛋白表達顯著增加(*P＜0.05,**P＜0.01)，持續(xù)至再灌注72h；ELISA結果顯示，與對照組相比，缺血再灌注后海馬CA1區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-6表達顯著上調(diào)(*P＜0.05,**P＜0.01,***p＜0.001)，而炎癥因子IL-1β表達無顯著差異。<

9、br>　　2.Western blot結果顯示，原代星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NDRG2和NF-κB蛋白表達在OGD/R后持續(xù)升高，其中OGD/R0h和OGD/R24 h最為明顯(*P＜0.05,**P＜0.01)。ELISA結果顯示，在OGD/R后原代星形膠質(zhì)細胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6分別在OGD/R0h和OGD/R2h開始增加，持續(xù)到OGD/R24h(*P＜0.05,**P＜0.01,***p＜0.001)，而IL-1β僅在OGD/

10、R24h分泌增加（*P＜0.05）。
　　結論：全腦缺血再灌注損傷后海馬CA1區(qū)NDRG2和NF-κB蛋白表達顯著上調(diào)，炎癥因子TNF-α和IL-6分泌明顯增加，而炎癥因子IL-1β無顯著變化。原代星形膠質(zhì)細胞OGD損傷后NDRG2和NF-κB蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6分泌明顯增加，而IL-1β僅在復氧復糖24h增加。
　　實驗三、抑制NF-κB下調(diào)NDRG2表達，減輕炎性反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用
　　目的：

11、觀察NF-κB特異性抑制劑PDTC對全腦缺血再灌注損傷后NDRG2及炎癥因子TNF-α和IL-6表達或分泌的影響及其神經(jīng)保護效應。
　　方法：
　　1.為研究PDTC對全腦缺血再灌注損傷后NDRG2蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響，將24只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組、GCI/R1d組、GCI/R2d組，GCI/R3d組，進一步將各組隨機分為Vehicle組和PDTC組。PDTC組小鼠于結扎雙側(cè)頸總動脈

12、前20min經(jīng)腹腔給予PDTC，Vehicle組小鼠則給予等體積的生理鹽水。在再灌注不同時間點取小鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)組織，用Western blot檢測NDRG2蛋白表達變化，用ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平。
　　2.為研究PDTC對OGD后星形膠質(zhì)細胞中NDRG2蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6水平的影響，體外行原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，建立OGD模型模擬腦缺血損傷。OGD前給予PDTC預處理1h，在復氧復糖

13、不同時間點（OGD/R12h，OGD/R24h）收集細胞及培養(yǎng)液。用Western blot檢測細胞中NDRG2蛋白表達變化，用ELISA檢測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6水平。
　　3.為觀察PDTC對全腦缺血損傷后神經(jīng)細胞的保護作用，將27只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組，GCI/R組，PDTC+GCI/R組，在再灌注3d或7d取腦組織進行HE染色，TUNEL染色和免疫熒光染色；離體實驗，給予原代星形膠質(zhì)細胞PDTC

14、1h預處理后與原代神經(jīng)元進行共培養(yǎng)并立即行OGD處理，分別用流式細胞儀和Western blot檢測OGD/R24h神經(jīng)元凋亡指數(shù)與Cleaved-caspase3蛋白表達變化。
　　結果：
　　1.在非缺血狀態(tài)下，PDTC不影響海馬CA1區(qū)NDRG2蛋白的表達水平，然而，在全腦缺血再灌注損傷后PDTC顯著下調(diào)NDRG2蛋白表達(＃P＜0.05)；ELISA結果顯示，PDTC不影響非缺血狀態(tài)下海馬CA1區(qū)炎癥因子TNF-α和

15、IL-6水平，全腦缺血再灌注后，PDTC組炎癥因子TNF-α和IL-6水平顯著低于Vehicle組(＃P＜0.05)。
　　2. Western blot結果顯示，PTDC不影響生理狀態(tài)下星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NDRG2表達，在OGD/R12h，OGD/R24h，PDTC明顯下調(diào)NDRG2蛋白水平(＃P＜0.05)；ELISA結果發(fā)現(xiàn)PDTC不影響生理狀態(tài)下炎癥因子TNF-α和 IL-6分泌，而OGD損傷后，PDTC顯著降低培養(yǎng)液中炎癥因

16、子TNF-α和IL-6水平(＃P＜0.05)。
　　3. HE染色結果顯示，與Con組相比，GCI/R組海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元胞體形態(tài)不規(guī)則，核深染、固縮，細胞嚴重受損，GCI+PDTC組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷明顯減輕；TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，GCI/R組TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯增加，PDTC顯著減少GCI后TUNEL陽性細胞數(shù)量(*P＜0.05)；GCI/R7 d行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，GCI后 NeuN陽性細胞數(shù)

17、量明顯減少(**P＜0.01)，而GCI+PTDC組NeuN陽性細胞數(shù)量較GCI/R組顯著增加(＃＃P＜0.01)。流式細胞計數(shù)結果顯示，OGD后神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著增加(***p＜0.001)，PDTC明顯減少神經(jīng)元凋亡(＃＃＃p＜0.001)；Western blot結果顯示，與Con組相比，OGD/R組Cleaved-caspase3表達明顯增加(**P＜0.01)，PDTC顯著下調(diào)OGD損傷后神經(jīng)元內(nèi)Cleaved-caspase

18、3蛋白水平(＃＃P＜0.01)。
　　結論：在缺血損傷后，PDTC下調(diào)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NDRG2表達水平，減輕炎性反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　實驗四、下調(diào)NDRG2表達減輕缺血損傷誘發(fā)的炎癥反應
　　目的：探討NDRG2在缺血損傷后炎癥反應中的作用
　　方法：
　　1.為驗證病病毒轉(zhuǎn)染的效能及效果，用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染的星形膠質(zhì)細胞系M1800細胞中表達GFP熒光蛋白細胞數(shù)量，用Western blo

19、t檢測NDRG2上下調(diào)細胞系中NDRG2蛋白表達水平。
　　2.為研究NDRG2在缺血損傷后炎癥反應中的作用，將NDRG2上下調(diào)細胞行OGD處理，在復氧復糖24h收集細胞培養(yǎng)液，用ELISA檢測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。
　　結果：
　　1.熒光結果顯示70-80％星形膠質(zhì)細胞表達GFP熒光蛋白，Western blot結果顯示，NDRG2下調(diào)組NDRG2蛋白表達較對照組顯著減少（**P＜0

20、.01），而NDRG2上調(diào)組NDRG2蛋白表達明顯增加(＃P＜0.01)。
　　2.ELISA結果顯示，與Con相比，shRNA-Con組和LV-Con組炎癥因子水平無明顯差異；與shRNA-Con組相比，shRNA-NDRG2組炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌顯著減少(*P＜0.05)；LV-NDRG2組炎癥因子TNF-α、IL-6水平較LV-Con組明顯增加(＃P＜0.05)，而炎癥因子IL-1β無顯著差異。