酶解羊乳酪蛋白制備抗氧化肽及其分離純化.pdf

1、自從自由基的理論提出以來，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體的許多疾病都與體內(nèi)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基相關(guān)，因此抗氧化肽就成為研究的熱點(diǎn)。抗氧化肽可以清除自由基，阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而幫助機(jī)體抵御疾病。食源性抗氧化肽具有安全有效、無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，備受關(guān)注。目前，乳源抗氧化肽的研究主要集中在牛乳，對(duì)于羊乳的研究尚少。陜西省具有豐富的羊乳資源，但羊乳產(chǎn)品相對(duì)單一，主要以羊奶粉為主，附加值不高。開展羊乳酪蛋白抗氧化肽的研究，可以開發(fā)羊乳酪蛋白抗氧化肽的產(chǎn)品，豐富羊

2、乳產(chǎn)品種類，提升羊乳產(chǎn)品的功效和附加值。
　　本課題以羊乳為原料，以羊乳酪蛋白為底物，選用七種蛋白酶水解羊乳酪蛋白，以水解度DH、DPPH自由基清除率、螯合鐵離子能力和超氧陰離子清除率為指標(biāo)，篩選出具有抗氧化活性高的蛋白酶。單因素、析因?qū)嶒?yàn)以及響應(yīng)面設(shè)計(jì)來優(yōu)化工藝條件。同時(shí)，將酶解液利用超濾、大孔樹脂脫鹽及凝膠色譜等分離純化抗氧化肽，研究結(jié)論如下:
　　1.以水解度DH和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，選用蛋白酶K、Alcala

3、se酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在各自適宜條件下水解羊乳酪蛋白。結(jié)果表明，Alcalase酶為水解羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的最佳用酶，Alcalase酶和木瓜蛋白酶為水解羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的最佳復(fù)合酶。
　　2.單因素實(shí)驗(yàn)考察了不同水解條件對(duì)Alcalase酶水解羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的影響，析因?qū)嶒?yàn)篩選出主因子，結(jié)果表明，影響羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的主要因素是pH、底物濃度和時(shí)間。爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)

4、面設(shè)計(jì)確定了最佳工藝參數(shù):溫度69℃、pH8.9、底物濃度4.4％、酶加量2％及時(shí)間172min，在此條件下，羊乳酪蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除率為（68.37±1.31）％，螯合鐵離子能力為(89.04±0.77)％，超氧陰離子清除率為(46.58±1.08)％。
　　3.單因素實(shí)驗(yàn)考察了不同水解條件對(duì)復(fù)合酶水解羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的影響，析因?qū)嶒?yàn)篩選出主因子，結(jié)果表明，影響羊乳酪蛋白制備抗氧化肽的主要因素為溫度、酶加量和復(fù)

5、合酶配比。爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定了最佳工藝參數(shù):溫度61℃、pH為9、底物濃度4％、酶加量5.6％、復(fù)合酶配比（EAlcalase∶E木瓜蛋白酶）為1.8∶1及時(shí)間180min，在此條件下，羊乳酪蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除率為（73.81±0.93）％、螯合鐵離子能力為（93.44±1.46）％以及超氧陰離子清除率為（51.69±1.17）％。
　　4.采用不同截留分子量的超濾膜超濾酶解液。研究表明，分子量低于1kDa的組分

6、DPPH自由基清除率最大，為81.25％，IC50的值最小，為0.842mg/mL，表明分子量小于1kDa的肽鏈抗氧化性強(qiáng)。DA201-C大孔樹脂進(jìn)一步分離1kDa酶解液，調(diào)節(jié)樣品pH為4的條件下吸附，70％濃度乙醇洗脫，脫鹽后的DPPH自由基清除率和IC50分別為83.62％和0.753mg/mL。
　　5.Sephadex G-15凝膠純化大孔樹脂脫鹽樣品。以蒸餾水為洗脫劑，上樣濃度80mg/mL，洗脫流速0.8 mL/min