高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、曲霉(Aspergillus spp.)是在發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)發(fā)揮著重要作用的菌種，廣泛的分布在自然界中。曲霉可以產(chǎn)生多種具有催化作用的酶，有機(jī)酸;此外還能產(chǎn)生一種重要的生理活性物質(zhì)——洛伐他汀(Lovastatin)，它具有重要應(yīng)用價(jià)值。Lovastatin已被廣泛用于防治人類(lèi)的心血管疾病，其主要原理是通過(guò)選擇性抑制羥甲基戊二酸輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性，并阻斷膽固醇生物合成。此外，Lovastatin在抗心律失常，防治糖尿

2、病，預(yù)防老年癡呆，抗感染和抗風(fēng)濕以及抗腫瘤作用上已有報(bào)道。目前，Lovastatin在食品和藥品工業(yè)中已被廣泛應(yīng)用。
　　本論文從自然界中分離純化、篩選1株高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株32號(hào)，通過(guò)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化提高Lovastatin產(chǎn)量，基于優(yōu)化結(jié)果完成發(fā)酵小試。
　　首先，從自然界（食品、土壤、空氣、有機(jī)質(zhì)等）中分離和純化的400余株菌株純培養(yǎng)為出發(fā)點(diǎn)，結(jié)合菌落自然生長(zhǎng)狀態(tài)和菌落顯微特征分離獲得150株曲霉

3、屬菌株。通過(guò)薄層層析法初篩產(chǎn)Lovastatin的菌株，之后再進(jìn)行高效液相色譜法復(fù)篩獲得一株遺傳性穩(wěn)定的高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株，產(chǎn)量為75.382μg/mL。經(jīng)過(guò)18S rDAN測(cè)序Blast序列比對(duì)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合自然生長(zhǎng)狀態(tài)及顯微特征，鑒定為棒曲霉，編號(hào)為Ac-32菌株。以Ac-32菌株為實(shí)驗(yàn)?zāi)康木赀M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　其次，為了進(jìn)一步提高Lovastatin的產(chǎn)量，對(duì)目的菌株的進(jìn)行培養(yǎng)基組分的優(yōu)化以及培養(yǎng)條件

4、的優(yōu)化，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得各單因子的最佳值，以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源、溫度為28℃、pH為5.2、碳源含量為100g/L、氮源含量為12g/L、C/N為15∶1.8、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min、種齡為4d、接種量為6％時(shí)，曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的水平最高，達(dá)144.021μg/mL，比優(yōu)化前提高了1.91倍。在此基礎(chǔ)上，使用Plackett-Burman法（P-B法）篩選出對(duì)Ac-32菌株發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin有重

5、要影響的四個(gè)因素分為是溫度，pH，碳源含量和氮源含量。運(yùn)用響應(yīng)面(RSM)Box-Behnken法獲得回歸系數(shù)，建立回歸方程:
　　Lovastatin=+234.14-7.05A+4.31B-13.41C+11.48D-3.20AB+9.19AC-8.65AD-5.40BC+5.80BD-3.96CD-21.53A2-32.51B2-11.11C2-12.30D2，在優(yōu)化后的條件為:氮源含量11.8g/L，碳源含量100g/L，

6、pH5.2，溫度28℃，轉(zhuǎn)接量為6％，轉(zhuǎn)速180rpm，種齡為4d，優(yōu)化后的Lovastatin產(chǎn)量達(dá)到224.626μg/mL。
　　再次，利用獲得的培養(yǎng)基最優(yōu)配方和發(fā)酵最佳條件，以Ac-32為目的菌株進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。通過(guò)建立5L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝及發(fā)酵產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，菌體生長(zhǎng)在72h達(dá)到最大值，120h以后進(jìn)入衰亡期;Lovastatin產(chǎn)量在108h后不再增高，最大值為235.02mg/L。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取，得到Lova

7、statin的127.07mg/L，計(jì)算后得率為54.07％。
　　最后，進(jìn)行Lovastatin對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌性試驗(yàn)。在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上分別選取了真菌:黃瓜枯萎病菌，小麥赤霉病菌，番茄早疫病菌，楊樹(shù)枯萎病菌和草酸青霉5種，細(xì)菌:大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和水稻白葉枯病菌4種。Lovastatin對(duì)以上5種真菌的抑菌性較為明顯，相對(duì)于真菌的抑菌性而言，Lovastatin對(duì)上述4種細(xì)菌的抑菌性除了對(duì)枯草芽孢桿菌的抑