薄荷呋喃生物轉化方法的初步研究.pdf

1、薄荷呋喃(Menthofuran)，又稱薄荷醇呋喃，化學名稱為4，5，6，7-四氫-3，6-二甲基苯并呋喃(4，5，6，7-tetrahydro-3，6-dimethylbenzofuran)，CAS號為494-90-6，化學結構式為()，分子式:C10H14O，分子量:150.22。薄荷呋喃存在于天然薄荷油中，具堅果香、咖啡香，可調(diào)配食用香精，安全添加濃度約為10mg/kg，使用廣泛。
　　天然薄荷呋喃主要提取自薄荷葉，產(chǎn)量少但

2、價格高，難以滿足市場的大量需求。因此，人們不斷嘗試通過化學法大量合成、制備薄荷呋喃。其中較為高效的化學合成法是氯代氧化法，但氯代氧化法所產(chǎn)生的薄荷呋喃中含有機氯，難以徹底去除且含量不符合食品使用的相關要求。
　　用氯氣氧化環(huán)氧異胡薄荷醇是氯代氧化法中的關鍵步驟，也是造成產(chǎn)品中有機氯殘留的根源。為尋找可以替代這一關鍵步驟的安全、綠色、環(huán)保的生物轉化方法，本文從商品酶轉化、重組酶轉化、菌株轉化等3個方面進行嘗試，試圖解決產(chǎn)品中氯氣殘留

3、問題。
　　首先，本文依據(jù)底物的母核結構與關鍵官能團、酶的基本性質和已有商品酶的種類，先后選取乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和多酚氧化酶等5種商品酶，分別以環(huán)氧異胡薄荷醇、異胡薄荷醇為底物進行轉化，并首先參照文獻分別構建了五種酶的轉化反應體系，繼而優(yōu)化反應條件，分別選擇酶活最高的體系作為環(huán)氧異胡薄荷醇、異胡薄荷醇的轉化體系。結果:乙醇脫氫酶能夠分別與環(huán)氧異胡薄荷醇、異胡薄荷醇發(fā)生作用，反應體系在340nm具有

4、特征吸收，但經(jīng)氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)分析總產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)環(huán)氧異胡薄荷酮、異胡薄荷酮的生成。
　　其次，用薄荷呋喃合酶和P450環(huán)氧酶2種重組酶分別以異胡薄荷醇為底物進行轉化。首先人工全合成薄荷來源的薄荷呋喃合酶(MFS)基因，并在大腸桿菌中表達該基因，由于薄荷呋喃合酶是膜蛋白且薄荷呋喃合酶催化底物反應時需NADH傳遞電子，因此優(yōu)化表達條件后，用重組菌株的細胞破碎混合物為粗酶液轉化異胡薄荷醇;其次，在大腸桿菌中表達來源于纖維

5、堆囊菌So0157-2的P450環(huán)氧酶(epoF)基因，該酶與薄荷呋喃合酶同屬于P450家族且底物特異性較小;上述2種重組酶與異胡薄荷醇反應時，選擇反應緩沖液、反應時間、反應溫度、產(chǎn)物是否酸化處理、與5種商品酶分別混合反應、是否添加雙氧水，以及是否添加NADPH等7個因子進行條件優(yōu)化，用薄板層析法分析比較上述2種重組酶對異胡薄荷醇的轉化作用，結果未檢測到薄荷呋喃的產(chǎn)生。
　　最后，本文從特定環(huán)境中分離能夠耐受或利用異胡薄荷醇的菌株

6、并利用菌株破碎物以異胡薄荷醇為底物進行轉化。(1)從新疆薄荷種植地土壤等3個樣品中分離到94株細菌并鑒定至芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等21個屬，從薄荷葉等樣品分離到78株真菌;分別檢測上述菌株對異胡薄荷的耐受性，發(fā)現(xiàn)22株細菌和34株真菌對0.5％(v/v)的異胡薄荷醇具有耐受性;用其中56株異胡薄荷醇耐受菌的細胞破碎物分別轉化異胡薄荷醇，薄板層析法未檢測到薄荷呋喃的生成;(2)用異胡薄荷醇富集新疆薄荷種植地土壤獲得混合菌株XJTA-F2，

7、用XJTA-F2發(fā)酵異胡薄荷醇，對21天和28天的發(fā)酵產(chǎn)物進行液相分析比較，結果28天的發(fā)酵產(chǎn)物中異胡薄荷醇的含量比21天明顯減少，進一步GC-MS分析，在21天與28天的發(fā)酵產(chǎn)物中均未檢測到薄荷呋喃。
　　綜上，本論文首次用生物轉化方法在體外合成香料化合物薄荷呋喃，但本文所嘗試的方法未能實現(xiàn)薄荷呋喃的體外合成與生物轉化。由于時間有限，本文篩選的酶與菌株較少，因此想要實現(xiàn)薄荷呋喃的體外合成需要嘗試更多數(shù)量和種類的酶與菌株。在后續(xù)研