黃芪多糖對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分泌炎癥因子的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、黃芪多糖(Astragalus Polydsaccharide,APS)是黃芪中最有效,含量最高的成分之一,具有增強(qiáng)免疫器官功能,促進(jìn)抗體的產(chǎn)生,提高巨噬細(xì)胞活性,加強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能等作用。
　　 內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌外膜的一種大分子結(jié)構(gòu)成分,可通過(guò)誘導(dǎo)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì),如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)

2、-1β及一氧化氮(NO)等,而導(dǎo)致許多病理生理反應(yīng)。抑制巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)已經(jīng)成為抗炎藥物研究和治療的靶點(diǎn)。用LPS誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞U937細(xì)胞(經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成熟),建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞模型,研究黃芪多糖對(duì)該細(xì)胞模型分泌的炎癥因子的影響及相關(guān)機(jī)制,為黃芪多糖對(duì)內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)的治療提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要工作如下:
　　 1.培養(yǎng)人單核巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞,體外PMA誘導(dǎo)其成熟。通過(guò)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)篩選黃芪多糖用藥濃

3、度。結(jié)果顯示,37.5～150μg/ml濃度范圍內(nèi)的黃芪多糖對(duì)經(jīng)PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。
　　 2.LPS誘導(dǎo)U937巨噬細(xì)胞,建立炎癥模型,加入不同濃度的黃芪多糖作用48h,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞各組細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量;采用Griess試劑檢測(cè)組細(xì)胞上清液中NO的含量;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β及i

4、NOS mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,LPS作用于PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β及NO的含量明顯增加(P＜0.01)。37.5～150μg/ml的黃芪多糖干預(yù)后,含量明顯下降,與LPS組比較有顯著性差異(P＜0.05)。LPS刺激后,TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。37.5～150μg/ml的黃芪多糖干預(yù)后,TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)與LPS組相

5、比顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(western blot)檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的含量。結(jié)果顯示,U937細(xì)胞經(jīng)LPS作用后,細(xì)胞內(nèi)NF-κBP65表達(dá)水平增高。黃芪多糖作用后,NF-κB P65表達(dá)水平與LPS組相比顯著降低。
　　 除了巨噬細(xì)胞外,淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞也是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生于機(jī)體的中樞淋巴器官和周?chē)馨推鞴?分布于外周血、脾臟

6、、全身各處淋巴結(jié)及PP結(jié)等處,在全身免疫系統(tǒng)及黏膜免疫系統(tǒng)內(nèi)免疫誘導(dǎo)部位及免疫效應(yīng)部位之間不斷的遷移,同時(shí)伴隨著淋巴細(xì)胞本身的分化成熟,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)作為機(jī)體功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs),它能快速有效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原,處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。黃芪多糖對(duì)免疫細(xì)胞活力及表型的影響可間接反映其免疫調(diào)節(jié)作用。本論文基于此進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):<

7、br>　　 1.取小鼠原代外周血單個(gè)核細(xì)胞、腋下淋巴結(jié)細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞及PP結(jié)淋巴細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)不同濃度的黃芪多糖對(duì)ConA誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示,37.5～300μg/ml濃度范圍內(nèi)的黃芪多糖能夠促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞、腋下淋巴結(jié)細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞及PP結(jié)淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
　　 2.取小鼠原代骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞,體外rmGM-CSF和IL-4誘導(dǎo)6天后,加入濃度為150μg/ml的