排斥性導(dǎo)向分子B(Repulsive guidance molecules B, RGMB)在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中已有研究表明排斥導(dǎo)向分子B（Repulsive guidance molecules B，RGMB）表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)肺癌組織內(nèi)RGMB表達(dá)相比于正常組織低，也發(fā)現(xiàn)RGMB低表達(dá)與腫瘤患者差預(yù)后相關(guān)，而RGMB分子對(duì)肺癌細(xì)胞功能影響仍未知。此外RGMB作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）的共表達(dá)受體，是

2、否會(huì)參與調(diào)控BMPs信號(hào)通路仍未知。為此，我們將探索RGMB分子對(duì)肺癌細(xì)胞功能的影響，以及RGMB分子調(diào)控肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。
　　研究方法：
　　采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法檢測(cè)人肺癌細(xì)胞株RGMB mRNA表達(dá)水平；構(gòu)建pLVX-mCMV-ZsGreen-puro-RGMB過(guò)表達(dá)載體和pLVX-ShRNA

3、-Puro-RGMB敲低載體；用RGMB過(guò)表達(dá)和敲低載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝得到慢病毒顆粒；用病毒顆粒感染肺癌細(xì)胞從而得到RGMB穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及穩(wěn)定敲低細(xì)胞株。通過(guò)細(xì)胞侵襲、黏附及轉(zhuǎn)移能力來(lái)研究RGMB對(duì)細(xì)胞功能的影響。Western blot檢測(cè)RGMB表達(dá)改變后BMPs信號(hào)通路中蛋白分子的表達(dá)及活化的改變。
　　研究結(jié)果：
　　在本實(shí)驗(yàn)中，首先我們采用rt-PCR法在mRNA水平檢測(cè)H520、Calu3、HCC827、PC

4、-9、H1650、Am1010、SPC-A-1、A0907、H1395、H1299、A549、H460肺癌細(xì)胞中RGMB mRNA的表達(dá)情況，成功選出常用且RGMB表達(dá)相對(duì)高的人肺癌細(xì)胞株A549用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　為了得到RGMB穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和穩(wěn)定敲低的A549細(xì)胞株，首先根據(jù)RGMB基因mRNA序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳得到RGMB mRNA全長(zhǎng)DNA，根據(jù)RGMB-ShRNA序列設(shè)計(jì)正義鏈和反義鏈，退火

5、后得到shRNA DNA序列；將PCR得到的RGMB DNA序列和退火得到的shRNA DNA序列分別與pLVX-mCMV-ZsGreen-puro和pLVX-ShRNA-Puro質(zhì)粒重組，從而成功構(gòu)建RGMB過(guò)表達(dá)和敲低的載體并通過(guò)PCR和基因測(cè)序驗(yàn)證；過(guò)表達(dá)載體和敲低載體通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝得到慢病毒顆粒；通過(guò)慢病毒顆粒感染A549細(xì)胞經(jīng)篩選最終得到RGMB穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和敲低的A549細(xì)胞。
　　為了研究RGMB基因?qū)54

6、9細(xì)胞功能的影響，我們選擇RGMB過(guò)表達(dá)株、敲低株和對(duì)照株對(duì)比其侵襲、浸潤(rùn)和遷移能力，結(jié)果顯示RGMB分子能抑制肺癌細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　進(jìn)一步探索RGMB是否參與BMP信號(hào)通路來(lái)影響肺癌的功能，我們選擇RGMB敲低A549細(xì)胞與對(duì)照組A549細(xì)胞株，用Western blot檢測(cè)BMP信號(hào)通路中蛋白分子，發(fā)現(xiàn)RGMB敲低組Smad-1/5/8磷酸化水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而ERK和JNK活化水平兩組相比未有明顯改變