新型電化學(xué)生物傳感器的研制及其在生物樣品檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、電化學(xué)生物傳感器是利用酶、抗體、微生物等作為敏感元件探測器，將探測器上所產(chǎn)生的物理量、化學(xué)量的變化轉(zhuǎn)換成電信號的一種裝置。它起源于1962年Clark等人報道的酶電極，該酶電極用葡萄糖氧化酶與氧電極組合來檢測葡萄糖。至今逐漸發(fā)展為一門生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等諸多學(xué)科綜合交叉的技術(shù)--生物傳感技術(shù)。因其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、所需儀器簡易等優(yōu)點，是當(dāng)前科學(xué)研究中普遍使用的檢測方法之一，在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析、

2、食品安全檢測等方面得到了高度重視和廣泛應(yīng)用。納米材料具有比表面積大、催化性能獨特和生物兼容性好等特點。將納米材料應(yīng)用于生物傳感器的制備，能夠有效地增強(qiáng)傳感器的電流響應(yīng)、提高靈敏度、降低檢測限，為生物傳感器的研制提供了廣闊的發(fā)展空間。
　　 本文充分利用生物傳感技術(shù)和納米技術(shù)的優(yōu)點，通過對傳感界面生物分子的固定和生物識別信號轉(zhuǎn)換的研究，致力于研制超高靈敏度、超高選擇性和穩(wěn)定性的新型電化學(xué)生物傳感器。同時，將制得的電化學(xué)生物傳感器分

3、別用于水體中大腸桿菌的檢測、乙酰膽堿酯酶活性損傷的研究以及腫瘤細(xì)胞表面糖基化的測定，取得了較好的成果。通過對ZnO納米棒、氧化硅納米微球、碳納米管等多種材料進(jìn)行功能化修飾，將抗體、酶、細(xì)胞等生物分子固定于其表面，進(jìn)而展開生物分子識別的研究。采用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等手段表征傳感器的形貌，以交流阻抗、循環(huán)伏安、示差脈沖等方法研究電活性物質(zhì)在生物傳感器表面的電化學(xué)性質(zhì)及響應(yīng)機(jī)理，從而實現(xiàn)了對不同生物樣品的檢測研究，為生命科學(xué)及其相

4、關(guān)領(lǐng)域的研究提供新方法。具體內(nèi)容如下：
　　 第一章：緒論。系統(tǒng)介紹了生物傳感器的概念和工作原理，根據(jù)檢測換能器的不同進(jìn)行了分類比較，著重介紹了電化學(xué)生物傳感器的特點。簡述了納米技術(shù)的發(fā)展及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用，介紹了電化學(xué)生物傳感器在三種生物樣品檢測中的應(yīng)用。最后闡述本論文的工作及意義。
　　 第二章：基于二茂鐵修飾的ZnO納米棒的電化學(xué)免疫傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測。將檢測抗體(dAb)和二茂鐵(Fc)共

5、同修飾于ZnO納米棒表面合成了{(lán)dAb-ZnO-Fc｝生物復(fù)合物，并將其用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測。該生物復(fù)合物中，二茂鐵作為電活性物質(zhì)產(chǎn)生電信號，檢測抗體用于免疫結(jié)合大腸桿菌。兩者的含量分別采用BCA蛋白測定法(BCA protein assay)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定，并對其在ZnO納米棒上的配比進(jìn)行了優(yōu)化。采用“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，首先將捕獲抗體(cAb)固定在巰基乙酸修飾的金電極表面，接著通

6、過免疫反應(yīng)結(jié)合大腸桿菌，進(jìn)而吸附{dAb-ZnO-Fc｝生物復(fù)合物，最后用示差脈沖伏安法檢測電極表面的二茂鐵信號。實驗結(jié)果表明，該法具有良好的分析性能，線性范圍為1.0×102～1.0×106 cfu/mL，檢出限為50 cfu/mL。通過富集濃縮，利用該電化學(xué)檢測方法可以檢測到醫(yī)院污水中5 cfu/10 mL的大腸桿菌。本方法具有操作簡單、靈敏度高等特點，可廣泛應(yīng)用于其它生物樣品的檢測。
　　 第三章：基于三維有序大孔復(fù)合材料

7、的新型電化學(xué)生物傳感器用于乙酰膽堿酯酶活性損傷的研究。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是一種絲氨酸水解酶，同時也是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，在神經(jīng)信號傳導(dǎo)過程中起著重要作用。AChE活性的異常變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病密切相關(guān)。本章研制了一種新型的乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并將其應(yīng)用于內(nèi)源性神經(jīng)毒素1(R)，2-二甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉[(R)-NMSal]對乙酰膽堿酯酶活性

8、抑制的作用機(jī)理研究。以SiO2納米微球修飾的玻碳電極作為模板，在離子液體(ionic liquid，IL)存在下電聚合聚苯胺(polyaniline，PANI)，然后用氫氟酸將SiO2模板溶解，形成IL-PANI膜。接著在該材料表面電鍍納米金(AuNPs)，得到三維有序的大孔AuNPs/IL-PANI復(fù)合材料。該復(fù)合材料形態(tài)多孔均勻，能夠有效地固定乙酰膽堿酯酶，且保持其生物活性。實驗結(jié)果表明，被固定的乙酰膽堿酯酶能高效地催化底物氯化硫代

9、乙酰膽堿(ATCh)生成硫代膽堿(Th)，產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)?；诖耍瑢⒃撋飩鞲衅鲬?yīng)用于乙酰膽堿酯酶活性抑制的作用機(jī)理研究，取得了滿意的結(jié)果。這為乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)理、藥物篩選以及酶生物傳感技術(shù)等方面提供重要的實驗依據(jù)。
　　 第四章：凝集素電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞表面多聚糖的檢測研究。研制了一種高靈敏度和高選擇性的凝集素電化學(xué)生物傳感器，并將其用于檢測甘露糖(mannose)和唾液酸(sialic ac

10、id)在人體肺、肝、前列腺組織中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平。采用碳納米管/納米金復(fù)合材料修飾電極(MWNT/AuNP/GCE)固定凝集素，利用細(xì)胞表面的多聚糖和凝集素之間的特異性結(jié)合將細(xì)胞吸附在傳感器表面，然后結(jié)合硫堇包被金納米粒子標(biāo)記的凝集素({lectin-Au-Th}生物復(fù)合物)構(gòu)建“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，最后用示差脈沖伏安法定量檢測硫堇，實現(xiàn)了對細(xì)胞表面多聚糖表達(dá)水平的測定。實驗結(jié)果表明，甘露糖在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水