小菜蛾對Bt Cry1Ac毒素抗性的分子機(jī)制研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)屬于革蘭氏陽性昆蟲病原微生物，由于其高效安全，Bt制劑已經(jīng)成為世界上用量最大的微生物殺蟲劑。Bt在產(chǎn)孢過程中產(chǎn)生的Cry類殺蟲晶體蛋白基因也已被轉(zhuǎn)入到多種重要的糧棉作物（Bt作物）中用于田間害蟲防治，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。然而，Bt制劑大量和不合理使用以及Bt作物的大面積種植不可避免的導(dǎo)致田間害蟲的Bt抗性進(jìn)化。而對昆蟲Bt抗性機(jī)制認(rèn)識的不足，正嚴(yán)重制約著B

2、t抗性治理和新型Bt殺蟲蛋白的開發(fā)與應(yīng)用，并嚴(yán)重威脅著轉(zhuǎn)Bt基因作物的使用壽命。因此，考慮到Bt生物殺蟲劑的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境重要性，闡明昆蟲Bt抗性分子機(jī)制對于延緩田間害蟲Bt抗性進(jìn)化和Bt的可持續(xù)應(yīng)用具有重要的意義。小菜蛾(Plutella xylostella)是一種世界性分布的十字花科作物重要害蟲，它能快速對各種殺蟲劑形成抗藥性，每年能在世界范圍內(nèi)引起40–50億美元的巨大經(jīng)濟(jì)損失。而且，小菜蛾是第一個在田間被報道對Bt噴灑制劑產(chǎn)生抗性

3、的害蟲。因此，小菜蛾已成為研究復(fù)雜的Bt抗性分子機(jī)制的模式昆蟲，特別是在最近其全基因組測序完成并公開后，這點表現(xiàn)的尤為明顯。盡管近年來研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾 Bt Cry1Ac抗性與BtR-1抗性基因座內(nèi)一個 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCC2)的基因突變有關(guān)，但是對小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的分子機(jī)制的全面理解仍然任重而道遠(yuǎn)。在本論文中，我們以多個小菜蛾Bt敏感和Bt Cry1Ac毒素/Btk制劑抗性種群為研究對象，通過一系列昆蟲毒理學(xué)、昆

4、蟲生理學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分子遺傳學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)和方法對小菜蛾Bt Cry1Ac抗性分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果表明，小菜蛾Bt Cry1Ac抗性與中腸鈣粘蛋白基因(PxCAD)和中腸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCH1)無關(guān)，而是與BtR-1抗性基因座內(nèi)有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號途徑上游轉(zhuǎn)錄激活的PxMAP4K4基因反式調(diào)控BtR-1抗性基因座外的中腸膜結(jié)合形式的堿性磷酸酶基因(PxmALP)和中腸 ABC

5、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCG1)以及BtR-1抗性基因座內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCC1-3)的差異表達(dá)密切相關(guān)。本研究結(jié)果對新型Bt作物的研發(fā)、害蟲對Bt作物/Bt制劑抗性的田間檢測與綜合治理、新型Bt殺蟲蛋白的開發(fā)與可持續(xù)應(yīng)用均有重要的理論和實踐意義。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　一、小菜蛾的室內(nèi)飼養(yǎng)、抗性汰選與毒力生物測定
　　利用實驗室良好的昆蟲飼養(yǎng)條件以及獨特的甘藍(lán)蘿卜苗法形成了一整套成熟標(biāo)準(zhǔn)的小菜

6、蛾室內(nèi)大規(guī)模人工隔離飼養(yǎng)技術(shù)，同時，形成了標(biāo)準(zhǔn)的小菜蛾幼蟲 Bt抗性汰選和毒力生物測定方法。毒力生物測定結(jié)果顯示，與Bt敏感小菜蛾種群相比，所有4個抗性小菜蛾種群對Bt Cry1Ac毒素/Btk制劑均形成了較高的抗性水平，為后續(xù)功能實驗的開展提供了良好的供試蟲源。
　　二、Bt Cry1Ac毒素與小菜蛾中腸BBMV蛋白結(jié)合分析
　　利用Western Blot技術(shù)對Bt Cry1Ac活化毒素與小菜蛾中腸BBMV蛋白的結(jié)合情況

7、進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明，所有Bt抗性小菜蛾種群中腸BBMV與Cry1Ac活化毒素的結(jié)合水平顯著性降低，這表明這些 Bt抗性小菜蛾種群的中腸受體發(fā)生變化（受體基因突變或表達(dá)量改變）是其對Bt產(chǎn)生抗性的主要分子機(jī)制。
　　三、小菜蛾中腸CAD基因與Bt抗性的關(guān)系研究
　　通過對小菜蛾Bt敏抗種群中腸PxCAD基因的全長cDNA序列進(jìn)行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該基因并未在 Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后，利用實

8、時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對PxCAD基因表達(dá)量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，小菜蛾Bt敏抗種群間該基因的轉(zhuǎn)錄水平并沒有顯著性差異。RNA干擾(RNAi)實驗結(jié)果表明PxCAD基因表達(dá)量降低并不影響小菜蛾敏感種群幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性。而且，遺傳連鎖實驗證實PxCAD基因與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀并不連鎖。因此，小菜蛾中腸PxCAD基因與Bt Cry1Ac抗性分子機(jī)制無關(guān)。
　　四、小菜蛾中腸ALP基因與Bt抗性關(guān)系的研究

9、
　　測定小菜蛾Bt敏抗種群的中腸BBMV樣品中ALP和APN的酶活力后結(jié)果顯示，與Bt敏感小菜蛾種群相比，所有Bt抗性的小菜蛾中腸BBMV樣品中ALP酶活力均顯著性降低，而APN的酶活力沒有顯著性變化，這表明小菜蛾中腸ALP基因可能與小菜蛾Bt抗性相關(guān)。隨后，利用RACE技術(shù)克隆了小菜蛾中腸膜結(jié)合形式的ALP基因(PxmALP)的全長cDNA序列。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，小菜蛾敏抗種群間PxmALP基因序列并無穩(wěn)定的突變位點。qPCR

10、結(jié)果顯示，與Bt敏感種群相比，所有小菜蛾 Bt抗性種群的 PxmALP基因在中腸組織中轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低。利用ELISA、免疫熒光定位和細(xì)胞毒性測定實驗證實了Sf9細(xì)胞重組表達(dá)的 PxmALP蛋白可以作為Bt Cry1Ac毒素的功能性受體。RNAi實驗結(jié)果表明PxmALP基因表達(dá)量降低可以導(dǎo)致小菜蛾幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性顯著性降低。而且，遺傳連鎖實驗證實PxmALP基因中腸表達(dá)量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖。因

11、此，小菜蛾中腸PxmALP基因表達(dá)量降低與Bt Cry1Ac抗性分子機(jī)制密切相關(guān)。
　　五、小菜蛾中腸ABCC1-5基因與Bt抗性關(guān)系的研究
　　利用遺傳連鎖圖譜定位數(shù)據(jù)、小菜蛾和家蠶全基因組數(shù)據(jù)以及小菜蛾和家蠶基因之間的遺傳共線性關(guān)系成功組裝了3.15Mb大小的BtR-1抗性基因座。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BtR-1抗性基因座內(nèi)含有5個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCC1-5)。在小菜蛾Bt敏抗種群中對PxABCC1-5基因的全

12、長cDNA序列進(jìn)行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，這5個基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后，qPCR實驗結(jié)果顯示，與小菜蛾Bt敏感種群相比，小菜蛾Bt抗性種群中腸PxABCC2和PxABCC3基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低，而中腸PxABCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性升高。利用RNAi沉默中腸PxABCC2和PxABCC3基因的表達(dá)量后能顯著降低小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性，而組合干擾PxmALP、PxABC

13、C2和PxABCC3基因的表達(dá)量后能進(jìn)一步降低其敏感性。更重要的是，遺傳連鎖實驗證實PxABCC2和PxABCC3基因表達(dá)量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖，然而PxABCC1基因表達(dá)量升高與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀并不連鎖。因此，小菜蛾中腸PxABCC2和PxABCC3基因表達(dá)量降低與Bt Cry1Ac抗性分子機(jī)制密切相關(guān)。
　　六、小菜蛾中腸MAP4K4基因與Bt抗性關(guān)系的研究
　　生物信息學(xué)分析后

14、發(fā)現(xiàn)，BtR-1抗性基因座內(nèi)還具有3個 MAPK信號途徑基因，其中，PxMAP4K4基因位于MAPK信號途徑上游且緊鄰PxABCC1-3基因。在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長cDNA序列進(jìn)行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后，qPCR實驗結(jié)果顯示，與小菜蛾Bt敏感種群相比，小菜蛾Bt抗性種群間中腸PxMAP4K4基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，表明該基因在小菜蛾Bt抗性種群中轉(zhuǎn)錄激活。利用RNA

15、i沉默小菜蛾抗性種群的中腸PxMAP4K4基因的表達(dá)量后能導(dǎo)致PxmALP、PxABCC2和PxABCC3基因的表達(dá)量顯著性升高以及PxABCC1基因的表達(dá)量顯著性降低并最終重建小菜蛾抗性種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此，小菜蛾MAPK信號途徑上游轉(zhuǎn)錄激活的PxMAP4K4基因能反式調(diào)控PxmALP和PxABCC1-3基因的表達(dá)量改變并最終導(dǎo)致小菜蛾對BtCry1Ac毒素產(chǎn)生高抗性。
　　七、小菜蛾中腸ABCG1基因

16、與Bt抗性關(guān)系的研究
　　對本實驗室小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組和RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析后發(fā)現(xiàn)一個全新的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCG1或Pxwhite)在Bt抗性小菜蛾種群中表達(dá)量顯著性降低。隨后，在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長cDNA序列進(jìn)行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后，qPCR實驗結(jié)果顯示，與小菜蛾Bt敏感種群相比，小菜蛾Bt抗性種群間中腸PxABCG1基因的轉(zhuǎn)錄水

17、平顯著性降低。利用RNAi沉默中腸PxABCG1基因的表達(dá)量后能顯著降低小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。而且，遺傳連鎖實驗證實PxABCG1基因表達(dá)量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖。因此，小菜蛾中腸PxABCG1基因表達(dá)量降低與Bt Cry1Ac抗性密切相關(guān)。
　　八、小菜蛾中腸ABCH1基因與Bt抗性關(guān)系的研究
　　對本實驗室小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組和RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析后發(fā)現(xiàn)了另一個

18、全新的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PxABCH1)在Bt抗性小菜蛾種群中表達(dá)量發(fā)生變化。在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長cDNA序列進(jìn)行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后，qPCR實驗結(jié)果顯示，在小菜蛾Bt敏抗種群間中腸PxABCH1基因表達(dá)量并無顯著性差異。利用低劑量dsRNA進(jìn)行RNAi沉默中腸PxABCH1基因的表達(dá)量后并不影響小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此，

19、小菜蛾中腸PxABCH1基因與Bt Cry1Ac抗性無關(guān)。然而，利用高劑量dsRNA進(jìn)行RNAi沉默中腸PxABCH1基因的表達(dá)量后卻能導(dǎo)致小菜蛾Bt敏抗小菜蛾種群在幼蟲期和蛹期全部死亡，這表明PxABCH1基因可以作為基于RNAi害蟲防治和抗性治理策略的優(yōu)秀靶標(biāo)基因。
　　總之，這些研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列小菜蛾Bt Cry1Ac抗性相關(guān)的關(guān)鍵基因并揭示了一種負(fù)責(zé)調(diào)控這些關(guān)鍵基因表達(dá)量的全新反式信號調(diào)控分子機(jī)制。因此，該研究在國際