不同DFR基因轉(zhuǎn)化矮牽牛研究.pdf

1、高等植物的花色主要受花色素控制,花色素主要由類黃酮、類胡蘿卜素、生物堿三類物質(zhì)組成,其中類黃酮包括原花青素、花青素苷、查爾酮等12類。在花青素苷合成途徑中二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)對(duì)花色素苷的最終形成起決定性作用。矮牽牛DFR主要催化DHM生成無色飛燕草素,對(duì)DHQ也有作用,而不能催化DHK,致使不存在天竺葵素的積累。小花矮牽牛是矮牽牛的同科近緣種,由于小花矮牽牛與矮牽牛親緣關(guān)系較近,DFR基因轉(zhuǎn)入更有希望改變矮牽?；ㄉ?。

2、　　本研究克隆了2個(gè)不同花色矮牽牛株系的DFR,全長(zhǎng)均為1473 bp,最大開放讀碼框?yàn)?143bp,編碼380個(gè)氨基酸。與NCBI公布的DFR-A相似性分別為93.8和99.6％,翻譯后的氨基酸組成相似性為98.2%和100%,驗(yàn)證了矮牽牛DFR屬Asp型。實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量測(cè)定表明矮牽牛DFR在葉片中幾乎無表達(dá),在初開花瓣中表達(dá)量最大,而盛開花瓣中略有下降,花藥中有極高的表達(dá)活性;除花藥以外,DFR酶活性變化規(guī)律與表達(dá)基本一致,

3、兩者存在線性相關(guān)性。內(nèi)源DFR酶活性在不同株系中表現(xiàn)差異較大,其中‘W115’中僅有較低酶活性,而‘Lx’中酶活性最大,‘2512’和‘9702’中的酶活性較接近,約為‘Lx’的1/10。UPLC測(cè)定中僅在‘9702’中檢測(cè)到矢車菊素-3-葡萄糖苷及飛燕草素存在。
　　通過RACE技術(shù)獲得小花矮牽牛DFR cDNA序列,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CaDFR屬于Asp型,第145位是谷氨酸。同時(shí)構(gòu)建了小花矮牽牛、番茄、月季、非洲菊DFR基因

4、的CaMV35S啟動(dòng)子正向表達(dá)載體,通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404對(duì)4個(gè)矮牽牛株系進(jìn)行轉(zhuǎn)化,以50mg/L卡那霉素為矮牽牛的篩選濃度。經(jīng)PCR檢測(cè)約57%抗性苗為陽性株,Southern雜交證實(shí)分別轉(zhuǎn)入了1~5拷貝的外源基因。
　　T0代花色改變明顯,其中‘LH26’一個(gè)分枝花色不變,另一分枝則為白花帶紫斑,‘LR25’為紫紅色花,‘9R9’、‘9H33’花藥變紫,花色為深紅色,‘9T19’、‘9H31’花色為粉紅相間的雜斑花,‘9

5、R8’、‘9H30’紅色花瓣帶粉斑,‘9R12’花顏色加深同時(shí)在邊緣出現(xiàn)一圈斑紋,‘9T18’則完全變?yōu)榉凵ā?1株‘WR’為粉色花,而且從花蕾幼期直到開花全過程中均為粉色,‘WR13’開出了一半白色一半粉色的花。
　　對(duì)‘9H33’和‘9R9’的表達(dá)分析表明,外源DFR基因在矮牽牛中的表達(dá)遠(yuǎn)高于內(nèi)源基因,最高可達(dá)64倍,在初開花瓣中都有相對(duì)高的表達(dá),但峰值出現(xiàn)的時(shí)間因基因不同而有差異。
　　不同來源的DFR在矮牽牛中的表

6、達(dá)對(duì)酶活性影響不同。外源DFR基因的轉(zhuǎn)入,可明顯提高酶活性,同時(shí)使酶的合成提前,分別在初開花瓣或盛開花瓣中達(dá)到最高峰。DFR酶活性與顏色存在較大相關(guān)性,顏色越深酶活性越高,且紫色株系較紅色株系具更高的酶活性。
　　花青素苷的UPLC檢測(cè)證實(shí)顏色加深的轉(zhuǎn)化子‘9R9’、‘9H33’、‘9R12’在矢車菊素-3-葡萄糖苷含量大幅增加的同時(shí),出現(xiàn)天竺葵素-3-葡萄糖苷吸收峰。在‘9702’轉(zhuǎn)化子中,DFR酶活性與花青素苷含量呈現(xiàn)出正相關(guān)