hPROKR2受體C末端相互作用蛋白的篩選與功能研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors， GPCRs)是迄今發(fā)現(xiàn)最大的受體超家族，其家族成員超過1000個。GPCRs一般包括7個跨膜區(qū)，3個細胞內(nèi)環(huán)區(qū)(IL1-3)和位于胞漿的C末端。幾乎所有細胞都表達種類多樣的GPCRs，它們與配體結(jié)合后激活G蛋白，從而啟動不同的信號通路并引起各種生物學效應(yīng)。GPCRs不僅能與G蛋白相互作用，也與一些稱做GPCRs互作蛋白(GPCRinteracting protei

2、ns， GIPs)的輔助蛋白相互作用。GIPs非常豐富，包括跨膜蛋白、離子通道、離子型受體、單次跨膜蛋白以及多種可溶性蛋白。這些蛋白質(zhì)參與GPCRs的轉(zhuǎn)運、靶向歸巢、信號傳導以及變構(gòu)調(diào)節(jié)等。GIPs中較多的是與GPCRs的C末端相互作用。
　　PROKR2屬于GPCR家族成員之一，與相應(yīng)配體—PK1或PK2結(jié)合后，可參與平滑肌收縮、血管生成、近日節(jié)律調(diào)節(jié)、以及促進神經(jīng)干細胞遷移。最近的遺傳學研究表明PROKR2的突變與卡爾曼綜合征

3、(Kallmann Syndrome，KS)以及特發(fā)性促性腺激素型性腺功能減退(Isolated hypogonadotropic hypogonadism，IHH)發(fā)病有關(guān)。KS和IHH表現(xiàn)為青春發(fā)育延遲和不孕。因此，研究與PROKR2相互作用的蛋白，不僅可以增強對PROKR2功能調(diào)節(jié)的了解，而且可以促進一些KS/IHH相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。
　　在本研究中，我們利用酵母雙雜交技術(shù)，以人PROKR2的C末端(333-384aa)為餌，

4、從人cDNA文庫中篩選與之相互作用的蛋白。我們首先獲得了8個有意義的cDNA克隆，從中我們選取SNAPIN進行進一步的研究。我們通過GST pulldown和免疫共沉淀實驗不僅證實了PROKR2與SNAPIN的相互作用，而且發(fā)現(xiàn)SNAPIN也可以與PROKR2的同源蛋白PROKR1的C末端相互作用。進一步的研究表明SNAPIN中包含aa37-136的片段為相互作用所必須，該區(qū)域包含H1和H2兩個α螺旋區(qū)。而PROKR2的C-末端的343

5、YFK345和351HWR353是相互作用所必須。免疫共沉淀實驗顯示，將343YFK345和351HWR353突變成丙氨酸之后得到的突變受體6A-PROKR2不能與SNAPIN相互作用。
　　PROKR2與配體結(jié)合之后導致受體內(nèi)吞，去掉配體之后，受體又可以迅速返回細胞膜。由于SNAPIN參與細胞內(nèi)的囊泡運輸，我們推測SNAPIN與PROKR2的相互作用可能參與了受體的內(nèi)吞或者重新上膜。RNA干擾內(nèi)源性SNAPIN之后，PROKR2

6、的內(nèi)吞不受影響，但是受體重新上膜受到抑制。相應(yīng)地，受體降解速度增加。這些現(xiàn)象也在SNAPIN結(jié)合缺陷的6A-PROKR2得到驗證。因此，我們的結(jié)果顯示SNAPIN促進了PROKR2的重新回膜。
　　本研究得出以下結(jié)論:
　　(1)通過酵母雙雜交、GST pulldown以及免疫共沉淀，我們篩選到一個PROKR2相互作用蛋白—SNAPIN;
　　(2)SNAPIN的相互作用區(qū)域位于aa37-136.其中包含H1和H2兩個