重組人胸腺肽α1在大腸桿菌中的表達(dá)與分離純化.pdf

1、人胸腺肽α1(Tα1)是由是人體中樞免疫器官胸腺組織上皮細(xì)胞所分泌的一種免疫活性極強(qiáng)的多肽激素，起著加強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的作用?？梢灾委熥陨砻庖呒膊∪缏砸腋?、丙肝、紅斑狼瘡等，還可作為治療癌癥的輔助藥物，在臨床上具有良好的療效。
　　 本研究首先選用大腸桿菌的偏愛密碼子合成重組人Tα,1(rhTα1)的全基因，并構(gòu)建了rhTα1的融合表達(dá)載體pET-rhTα1，然后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得了rhTα1的高水平表達(dá)

2、。通過對基因工程菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，得出了優(yōu)化后的發(fā)酵條件：基因工程菌培養(yǎng)14h后進(jìn)入衰退期，因此培養(yǎng)14h內(nèi)終止發(fā)酵；培養(yǎng)基組成為葡萄糖6g/L、胰蛋白胨15g/L、酵母提取物10g/L、NaCl10g/L、K2HPO411g/L、KH2PO44.6g/L、NH4Cl2.2g/L、MgSO41.1g/L、FeSO445mg/L;接種量為10％;誘導(dǎo)時機(jī)為對數(shù)生長期的中期，此時OD600為6.0;誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1.0mmol/L

3、;誘導(dǎo)時間6h。
　　 重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)時易形成不溶性、無活性的包涵體，因此，必須經(jīng)過體外變性、復(fù)性的過程。而稀釋復(fù)性法是研究其它復(fù)性方法的基礎(chǔ)，試驗(yàn)中先用含2mol/L尿素的0.1mol/LTris-HCl緩沖液對包涵體進(jìn)行洗滌，然后用含10mmol/LDTT的7mol/L鹽酸胍溶解包涵體。在冰浴0℃下采用脈沖加樣的操作方式使包涵體蛋白復(fù)性。變性復(fù)性后的產(chǎn)物后經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子

4、交換層析柱純化后，每升菌液可獲得260mg融合蛋白，在SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上得到分子量為7200D的譜帶；重組經(jīng)腸激酶酶切后，釋放出rhTα1單體，先經(jīng)Ni-Sepharose親和層析除去殘留肽，然后經(jīng)SephadexG-25凝膠層析柱純化，得到純度達(dá)97％的rhTα1，產(chǎn)量達(dá)82mg/L。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法測定rhTα1的分子量為3067.179D（理論值為3065.25D，因N端未被乙?；?，與理論值基本