2型豬鏈球菌IV型分泌系統(tǒng)virB1-89K基因的生物學(xué)功能研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcussuisserotype2,SS2)是一種重要的人畜共患傳染病病原體,它不僅可以導(dǎo)致豬感染和急性死亡,還可以通過傷口和呼吸道等途徑傳染給人,使人致病甚至死亡。以往國內(nèi)外報(bào)道的人感染SS2多為散發(fā)病例,且臨床表現(xiàn)多以敗血癥和腦膜炎為主,愈后較好。然而,1998年和2005年在我國江蘇和四川兩省暴發(fā)的兩次大規(guī)模SS2感染豬和人的公共衛(wèi)生事件中,病人出現(xiàn)了高比例的鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptoc

2、occal toxic shock syndrome,STSS),臨床表現(xiàn)為高熱、休克、多器官衰竭等,病程短且病死率極高(62.7％-81.3%),引起了國內(nèi)外高度關(guān)注。目前,SS2的高致病性及引發(fā)STSS的機(jī)制尚不清楚。
　　為了對(duì)引發(fā)兩次公共衛(wèi)生事件SS2流行菌株的高致病性進(jìn)行研究,本課題組陳晨等人前期通過全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這兩次流行的菌株中含有一個(gè)89K毒力島(PAI89K),且在以往的SS2中并沒有發(fā)現(xiàn),

3、而是兩次大暴發(fā)的SS2菌株所特有的,提示這個(gè)毒力島可能與其引發(fā)的高致病性相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在89K毒力島上編碼了一個(gè)IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)。T4SS是與細(xì)菌接合機(jī)制有關(guān)的一種分泌系統(tǒng),在革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、支原體、古細(xì)菌等中都有存在。它具有非常廣泛的分泌底物,包括單個(gè)的蛋白、蛋白-蛋白復(fù)合體、蛋白-DNA復(fù)合體。它不僅可以通過細(xì)菌間的接合作用介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移,在細(xì)菌間傳遞抗性基

4、因和毒力基因,還可以將效應(yīng)蛋白分子注入宿主靶細(xì)胞,直接參與細(xì)菌致病過程。本課題組在PAI89K上發(fā)現(xiàn)的這個(gè)T4SS系統(tǒng),由05SSU0968、05SSU0969、05SSU0971、05SSU0973基因編碼產(chǎn)物組成,分別與根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacien)T4SS系統(tǒng)中VirB1、VirB4、VirB6和VirD4蛋白有一定相似性,因此我們將PAI89K中T4SS系統(tǒng)各組分命名為VirB1-89K、VirB

5、4-89K、VirB6-89K和VirD4-89K。在根癌農(nóng)桿菌中,VirB1作為一種胞質(zhì)蛋白,除了促進(jìn)T菌毛亞單位形成以外,還具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,能夠裂解N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid,MurNAc)之間的β-1,4糖苷鍵分解細(xì)胞壁肽聚糖,在T4SS系統(tǒng)的裝配和致病菌效應(yīng)分子分泌過程中起到了重要的作用。然而,PAI89K中的VirB1-

6、89K組分與根癌農(nóng)桿菌中VirB1組分在蛋白質(zhì)水平上只有10.3%的同源性,尚不足以說明VirB1-89K具有相應(yīng)的功能,且SS2和根癌農(nóng)桿菌分屬革蘭陽性和革蘭陰性菌,二者的細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)有著很大的差異。因此,為了了解PAI89K中VirB1-89K的功能,本研究通過對(duì)virB1-89K(05SSU0968)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,擬運(yùn)用蛋白純化技術(shù)獲得純化的VirB1-89K蛋白并對(duì)其酶學(xué)功能進(jìn)行初步探索,再通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建vi

7、rB1-89K基因缺失株,研究virB1-89K基因與SS2高致病性之間的關(guān)系。其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:
　　1)IV型分泌系統(tǒng)virB1-89K基因生物信息學(xué)分析:利用NCBI(National Centerof Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫上提供的BLAST工具(basic local alignment searchtool)對(duì)89K毒力島上的05SSU0968基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行檢索分析

8、,發(fā)現(xiàn)與根癌農(nóng)桿菌中的VirB1蛋白相似性不高,于是又運(yùn)用Pfam軟件(http://pfam.sanger.ac.uk/)對(duì)05SSU0968基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示05SSU0968基因編碼產(chǎn)物VirB1-89K含有一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)CHAP(cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidases)功能域。于是又通過BLAST檢索獲取了SS2VirB1-89K的同

9、源蛋白以及其他細(xì)菌中的VirB1蛋白,進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)生樹分析,結(jié)果提示VirB1-89K蛋白與停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)和糞腸球菌(Enterococcus faecium)中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的進(jìn)化距離最近,而與其他已確定的VirB1蛋白進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示VirB1-89K蛋白與腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)中含有CH

10、AP功能域的酰胺酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相似,并都含由組氨酸和半胱氨酸組成的活性中心。所有結(jié)果均提示SS2VirB1-89K蛋白可能為一種具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的水解酶,但尚需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
　　2)virB1-89K基因CHAP功能域的克隆、表達(dá)與純化:通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增到virB1-89K基因的CHAP功能域DNA片段,并將其插入原核表達(dá)載體pET-21a中,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21a-CHAP。該重組質(zhì)粒經(jīng)

11、NdeI和XhoI雙酶切鑒定正確后,送華大基因測(cè)序顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)到大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌。通過優(yōu)化條件使目的蛋白在上清中表達(dá),故對(duì)融合蛋白上清行非變性Ni-NTA柱親和層析,最后獲得單一條帶的目的蛋白。
　　3)VirB1-89K蛋白CHAP功能域酶活性的測(cè)定:提取并純化SS2細(xì)胞壁肽聚糖,采用酶譜電泳法、抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VirB1-89K蛋白CHAP功能域?qū)?xì)胞壁

12、肽聚糖的降解活性,結(jié)果表明VirB1-89K蛋白CHAP功能域?qū)S2肽聚糖具有顯著降解作用。進(jìn)一步通過濁度實(shí)驗(yàn)確定VirB1-89K蛋白CHAP功能域酶活性的最適合pH值為8,最適溫度為40℃以及酶的熱穩(wěn)定性。
　　4)virB1-89K基因敲除株和互補(bǔ)株的構(gòu)建:以05ZYH33基因組為模板,分別擴(kuò)增virB1-89K基因的上下游片段和pSET2上的Spcr(spectinomycin resistance cassette)基

13、因,然后依次克隆于pUC18質(zhì)粒中,構(gòu)成敲除質(zhì)粒。再將其電轉(zhuǎn)化到05ZYH33感受態(tài)細(xì)胞中,篩選含spc抗性的菌株,并通過多重PCR和測(cè)序確定敲除株構(gòu)建成功。再以05ZYH33基因組為模板,分別擴(kuò)增SS2的sly基因啟動(dòng)子(Psly)和virB1-89K基因,克隆到pSET1穿梭質(zhì)粒中,構(gòu)成互補(bǔ)質(zhì)粒,然后電轉(zhuǎn)入virB1-89K敲除株感受態(tài)細(xì)胞中,用Cm和Spc雙重抗性平板初篩互補(bǔ)株后,最后用PCR驗(yàn)證互補(bǔ)株構(gòu)建成功。
　　5)?

14、virB1-89K菌株基本生物學(xué)特性和毒力變化分析:在相同培養(yǎng)條件下觀察野生株05ZYH33、敲除株?virB1-89K、互補(bǔ)株CvirB1-89K基本生物學(xué)性狀有無差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三者生長曲線、溶血活性、莢膜形態(tài)均沒有明顯差異。當(dāng)用相同致死劑量的三株細(xì)菌分別攻擊BALA/c小鼠時(shí),發(fā)現(xiàn)野生株和互補(bǔ)株都出現(xiàn)了典型的SS2感染癥狀,12h小鼠死亡率為100%,而突變株組的小鼠攻擊12h后全部存活,截止觀察時(shí)間7天結(jié)束,小鼠仍有70%的存活

15、率,且均未發(fā)現(xiàn)有任何發(fā)病癥狀?；パa(bǔ)株與野生株的情況基本吻合,24h內(nèi)小鼠全部死亡。結(jié)果表明:virB1-89K基因的缺失導(dǎo)致細(xì)菌致病性大大降低。
　　綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)VirB1-89K可能是一個(gè)N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶,并通過實(shí)驗(yàn)證明其確實(shí)具有裂解肽聚糖的活性。再通過構(gòu)建virB1-89K基因敲除株和互補(bǔ)株,發(fā)現(xiàn)virB1-89K基因缺失后細(xì)菌基本生物學(xué)性狀并沒有明顯改變,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:virB1-8