天藍(lán)色鏈霉菌sco1135調(diào)控孢子生長(zhǎng)和ACT次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建突變菌株，篩選得到與野生菌株有差異的基因；⑵研究差異基因的功能。
　　方法：①?gòu)腗145基因文庫(kù)中選取sco1135、sco5131/5132、sco5434/5435、sco6139/6140和sco6253/6254的陽(yáng)性克隆，分別得到7B11、22F9、22A3、13C12和11D6陽(yáng)性文庫(kù)克隆。通過(guò)PCR-targeting技術(shù)在陽(yáng)性克隆中實(shí)現(xiàn)目的基因的突變，然后通過(guò)大腸桿菌與鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移，得到了基因的

2、缺失突變菌株△sco1135、△sco5131/5132、△sco5434/5435、△sco6139/6140和△sco6253/6254。通過(guò)比較野生菌型M145和各突變菌株在YBP、R2、R2YE、R5和MM固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在YBP固體培養(yǎng)基上，△sco1135氣生菌絲的形成明顯延遲，產(chǎn)藍(lán)(ACT)增多;其他菌株在五種固體培養(yǎng)基上與M145相比，并沒(méi)有明顯的表型差異。②為驗(yàn)證△sco1135的表型差異是由sco1135

3、的基因缺失引起的，對(duì)△sco1135進(jìn)行回補(bǔ)，并通過(guò)RT-qPCR分析M145和△sco1135中與孢子發(fā)育和次級(jí)代謝合成相關(guān)基因的表達(dá)差異來(lái)界定sco1135的調(diào)控基因群。③sco1135基因進(jìn)行異源表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴構(gòu)建了基因缺失突變菌株△sco1135、△sco5131/5132、△sco5434/5435、△sco6139/6140和△sco6253/6254，發(fā)現(xiàn)在YBP固體培養(yǎng)基上，△sco1135氣生菌絲的形成明顯

4、延遲，產(chǎn)藍(lán)(ACT)增多;其他菌株在五種固體培養(yǎng)基上與M145相比，并沒(méi)有明顯的表型差異。⑵回補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢和產(chǎn)素等均得到了明顯恢復(fù)，說(shuō)明△sco1135的表型變化是由sco1135的突變引起的。qRT-PCR的分析結(jié)果表明△sco1135中與形態(tài)發(fā)育相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá)明顯下調(diào)，包括編碼氣生菌絲表面疏水性外鞘組份的chp基因和調(diào)控形態(tài)發(fā)育的whi基因，△sco1135中調(diào)控放線(xiàn)紫紅素的act基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，說(shuō)明sco1135對(duì)天