FHL2對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞生長的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、FHL2(Four and a half LIM domains protein2)是FHL蛋白家族成員之一，可作為轉(zhuǎn)錄因子共結(jié)合因子，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄等諸多過程。目前，基于FHL2的研究主要集中在心臟、骨骼和癌癥中，對生殖發(fā)育方面的研究較少。研究表明，F(xiàn)HL2在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，可通過結(jié)合NR5A1，調(diào)控抑制素α基因的轉(zhuǎn)錄，提示FHL2對生殖具有重要調(diào)控作用，但調(diào)控作用及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實驗

2、以昆明小鼠卵巢顆粒細(xì)胞(mGCs)為模型，研究FHL2對小鼠顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用及作用機(jī)制，旨在為闡明哺乳動物卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1) FHL2在小鼠卵巢中的時空表達(dá)與定位規(guī)律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢，免疫組化實驗結(jié)果表明，F(xiàn)HL2的表達(dá)量隨著卵泡組裝和原始卵泡池的形成逐漸升高，在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均有表達(dá);Western Blot檢測結(jié)果顯示，出生后1天、4天和7天小

3、鼠卵巢FHL2表達(dá)量逐漸上升;
　　(2) FHL2在顆粒細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):Western Blot和免疫熒光方法證明，F(xiàn)HL2在mGCs細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，定位與細(xì)胞所處的分裂周期有關(guān);
　　(3) FHL2促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞的增殖:體外培養(yǎng)小鼠顆粒細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染FHL2小干擾RNA或過表達(dá)質(zhì)粒，CCK-8、細(xì)胞計數(shù)，流式細(xì)胞分析方法結(jié)果表明，敲低FHL2后，細(xì)胞活力顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著

4、增加;過表達(dá)FHL2，則可以顯著促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞生長，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡;
　　(4) FHL2通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB調(diào)控EGF和EGFR轉(zhuǎn)錄:轉(zhuǎn)染FHL2 siRNA后，敲低組EGF和EGFR的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量顯著降低，而超表達(dá)FHL2則顯著提高EGF和EGFR的表達(dá)量;進(jìn)一步利用Co-IP和CHIP方法證明，F(xiàn)HL2分別結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控EGF和EGFR的表達(dá);<

5、br>　　(5) EGF對小鼠顆粒細(xì)胞生長的調(diào)控依賴于FHL2表達(dá)量:EGF(20 ng/mL)可顯著促進(jìn)mGCs增殖、提高細(xì)胞活力，提高S期細(xì)胞比例;敲低FHL2后，EGF對顆粒細(xì)胞的促增殖作用受到抑制，提示EGF對小鼠顆粒細(xì)胞的調(diào)控依賴于FHL2表達(dá)量;此外，EGF處理可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞EGF和EGFR的表達(dá)量顯著上升;敲低FHL2后再用EGF處理，EGF對其自身和其受體的誘導(dǎo)作用被顯著抑制;
　　(6) EGF可促進(jìn)FHL2表達(dá)

6、，尤其是誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)FHL2表達(dá)量上調(diào):上述實驗說明，EGF通路可能與FHL2存在互作，為進(jìn)一步驗證該假設(shè)，利用EGF處理小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，結(jié)果表明，EGF(20 ng/mL)處理可誘導(dǎo)mGCs FHL2表達(dá);而分別添加EGFR抑制劑(AG1478)、MEK抑制劑(UO126)和PI3K抑制劑(LY294002)則可以阻斷EGF對FHL2表達(dá)的調(diào)控，說明EGF可通過結(jié)合EGFR，激活MEK和PI3K信號通路，參與小鼠顆粒細(xì)胞FHL2的表

7、達(dá)調(diào)控;免疫熒光檢測結(jié)果顯示，EGF可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞核內(nèi)FHL2表達(dá)量顯著上調(diào);Western Blot結(jié)果進(jìn)一步表明，隨EGF處理時間的增加，F(xiàn)HL2在核內(nèi)表達(dá)的表達(dá)量逐漸增加，呈時間依賴模式。
　　在本研究中，發(fā)現(xiàn)FHL2在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，并參與顆粒細(xì)胞的生長調(diào)控。EGF與EGFR在細(xì)胞膜上結(jié)合，激活MEK和PI3K信號通路，調(diào)控FHL2表達(dá)，并促進(jìn)FHL2在細(xì)胞核內(nèi)聚集，而核內(nèi)FHL2可作為轉(zhuǎn)錄因子共激活子，通過結(jié)合轉(zhuǎn)