普通小麥和中國節(jié)節(jié)麥LMW-GS,α-,γ-醇溶蛋白基因的克隆與序列分析.pdf

1、面筋蛋白不僅是決定小麥加工品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且是誘發(fā)乳糜瀉(celiac disease，CD)的主要外在刺激因子，篩選優(yōu)質(zhì)的面筋蛋白相關(guān)基因，對小麥加工品質(zhì)的分子改良和CD預(yù)防具有重要的意義。HMW-GS組成已成為品質(zhì)育種中親本選配的主要依據(jù)，篩選優(yōu)質(zhì)的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因，是當(dāng)前改良我國小麥加工品質(zhì)的關(guān)鍵。普通小麥豫麥34、鄭麥9023，鄭麥004和鄭豐5號，是我國黃淮麥區(qū)主要推廣種植的優(yōu)質(zhì)小麥品種，中國節(jié)節(jié)麥，作為

2、普通小麥D基因組的祖先供體種，具有其它譜系節(jié)節(jié)麥所缺乏的獨特遺傳變異，是小麥遺傳改良的寶貴種質(zhì)資源。因此，為篩選具有獨特變異的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白優(yōu)質(zhì)基因和對小麥品質(zhì)改良和CD預(yù)防有利用價值的寶貴節(jié)節(jié)麥種質(zhì)資源，本研究在中國節(jié)節(jié)麥ISSR遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上，采用PCR法，對4個優(yōu)質(zhì)小麥品種和2-7份代表性節(jié)節(jié)麥的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因進(jìn)行系統(tǒng)的分子克隆，并利用GenBank中已注冊的大量基因資源，通過氨基酸

3、序列和二級結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)比較分析，不同分子結(jié)構(gòu)基因的原核表達(dá)、純化和qRT-PCR分析，揭示優(yōu)質(zhì)小麥優(yōu)質(zhì)的分子基礎(chǔ)、CD毒性和LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。為我國小麥加工品質(zhì)的分子改良，以及中國節(jié)節(jié)麥在小麥品質(zhì)改良和CD預(yù)防中的有效利用，奠定重要的研究基礎(chǔ)和參考資料。主要取得如下結(jié)果:
　　(1)從4個小麥品種和2-7份代表性中國節(jié)節(jié)麥中，共克隆注冊了638(GenBank登錄號為:JN831382-JN831

4、435，JN849083-JN849096， JX828193-JX828401，KC715868-KC716082,KF278601-KF278638,KF412579-KF412621和KF880532-KF880594)個LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白新基因，篩選到76個在重復(fù)區(qū)長度和半胱氨酸殘基數(shù)量存在獨特變異的基因資源和2份含有較少T細(xì)胞免疫肽的節(jié)節(jié)麥種質(zhì)資源。
　　(2)推斷氨基酸序列的比對分析表明，在C-末端Ⅰ區(qū)和

5、C-末端特征區(qū)Ⅱ存在額外半胱氨酸殘基的LMW-GS，α-醇溶蛋白基因，絕大多數(shù)來源D基因組，而在N-末端重復(fù)Ⅱ區(qū)存在1個額外半胱氨酸殘基的γ-醇溶蛋白基因，絕大多數(shù)來源于B基因組，且均在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成1個相對集中的分支。盡管LMW-GS中存在較少含有額外半胱氨酸殘基的基因，但體外功能鑒定已證明D基因組來源的1個含額外半胱氨酸殘基的基因，對面筋品質(zhì)有顯著影響。可見，與Glu-D1位點編碼的HMW-GS對品質(zhì)有獨特貢獻(xiàn)一樣，Glu-D3，

6、Gli-D2和Gli-B1位點編碼的LMW-GS和α-，γ-醇溶蛋白，也對面筋品質(zhì)密切相關(guān)。
　　(3)二級結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)預(yù)測和比對分析表明，LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)單元的形成位置有一定的保守性，但不同蛋白形成α-螺旋和β-折疊的數(shù)目、以及同一位置形成二級結(jié)構(gòu)單元的長度卻并不相同。其中，α-醇溶蛋白的2個特征區(qū)，γ-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺Ⅳ區(qū)和C-末端非重復(fù)Ⅴ區(qū)，LMW-GS的C-末端特征Ⅰ區(qū)和C-末端特征Ⅲ區(qū)，是α

7、-，γ-醇溶蛋白和LMW-GS重要的分子功能區(qū)。而對代表不同等位變異和不同單倍型的LMW-GS基因的二級結(jié)構(gòu)的比對分析表明，Glu-D3位點，尤其是D3-2和D3-4型LMW-GS，對小麥加工品質(zhì)的貢獻(xiàn)最大，而Glu-A3位點的貢獻(xiàn)最小。
　　(4)對豫麥34中不同分子結(jié)構(gòu)的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白的原核表達(dá)和qRT-PCR分析表明，體外高水平的原核表達(dá)，仍存在一定難度。但不同分子結(jié)構(gòu)基因同期的表達(dá)水平存在明顯差異。含有1

8、個額外半胱氨酸殘基或形成較多二級結(jié)構(gòu)單元的優(yōu)質(zhì)候選LMW-GS，α-醇溶蛋白基因，表達(dá)水平明顯高于經(jīng)典基因，可能是影響小麥面筋品質(zhì)的主要低分子量面筋蛋白組分。
　　(5)對5種分布于α-，γ-醇溶蛋白的主要T細(xì)胞免疫優(yōu)勢多肽的識別分析表明，4個優(yōu)質(zhì)小麥品種均含有較多的T細(xì)胞免疫肽，有足夠的潛力導(dǎo)致CD的發(fā)生。但一粒小麥和節(jié)節(jié)麥野生種質(zhì)資源中，不含或含有較少T細(xì)胞免疫肽的例外基因的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步說明篩選并培育CD患者耐受的普通小麥品種

9、是可能的。
　　(6)77份中國節(jié)節(jié)麥的ISSR遺傳多樣性和2-7份代表性節(jié)節(jié)麥的LMW-GS，α-，γ-醇溶蛋白基因的克隆和序列分析表明，黃河流域的中國節(jié)節(jié)麥，具有更廣泛的遺傳變異，尤其是ISSR聚類圖中位于GroupⅡ和GroupⅢ的黃河流域節(jié)節(jié)麥，至少是本實驗采用的T006和SC-1，具有獨特的遺傳變異。不僅α-醇溶蛋白基因中不含或僅含有少數(shù)的T細(xì)胞免疫肽，γ-醇溶蛋白大多數(shù)在N-末端重復(fù)區(qū)含有1個額外的半胱氨酸殘基，而且L